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不同培养条件对奶牛体外受精效果的影响 　　摘要：为了提高奶牛体外受精效果，研究了体外成熟卵母细胞在IVF-100、BO、TALP 3种体外受精液中的受精效果，同时比较了裸卵（NOs）与卵丘卵母细胞复合体（COCs）对受精效果的影响。结果显示，体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率显著高于BO液（P0.05）；裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著（P0.05）；NOs的囊胚率极显著低于COCs（P0.01）。不同受精液及有无卵丘细胞对卵母细胞的体外受精效果有明显的影响。 　　关键词：奶牛；卵母细胞；体外受精；卵裂率；囊胚率 　　中图分类号： S823.9+13文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）15-0137-02 　　随着配子与胚胎生物技术的研究与应用，对胚胎的需求量越来越大。超数排卵和胚胎移植的合理化应用虽能成倍提高优良母畜的繁殖率，但所获得的胚胎数量有限。为了解决这个问题，近年来国内外对奶牛卵母细胞体外受精技术进行了大量的研究。保国俊等通过体外受精技术提供了更多数量、更低成本的胚胎[1-2]，IVF技术是对品种优良的公畜、母畜发挥出超常繁殖能力的一种应用。 　　由于体外受精技术操作环节十分复杂，影响结果因素较多，且卵母细胞在体外的生长繁殖对生存环境要求特别高，易导致试验体系不够稳定，从而对试验结果的准确性造成很大影响[3-4]。本研究通过对比3种受精液对卵母细胞体外受精效果的研究，以其为基础来研制出更好的受精液，进而加快我国奶牛业的发展，提高经济效益。裸卵和卵丘卵母细胞体外受精后，都可以发育到囊胚阶段，但裸卵的囊胚率显著低于卵丘卵母细胞的囊胚率。通过对比2种卵母细胞的囊胚率，对体外受精时卵母细胞的筛选起着重要作用。本试验就不同受精液、不同形态的卵子对奶牛成熟卵母细胞体外受精能力的影响进行了研究，皆在为优化奶牛体外受精提供参考依据。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1卵巢的采集与保存 　　本试验所用奶牛卵巢来自河南省郑州市郊个体屠宰场。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪组织，然后用加有双抗的生理盐水冲洗5～6次，保存在装有37 ℃左右、加有双抗的灭菌生理盐水中，于2～3 h内带回实验室。 　　1.1.2主要试剂 　　胎牛血清（FBS）（Biotech，P40-47500）；肝素钠（Sigma，H3149-25KU）；石蜡油（Sigma）；TCM-199（Gibco）；NaCl（Sigma，S-5886）；KCl（Sigma，P-5405）；NaH2CO3（Sigma，S-5761）；NaH2PO4（Sigma，RDD007）；CaCl2?2H2O（Sigma，C-5080）。 　　1.2试验方法 　　抽吸法：用无菌纱布将卵巢表面擦干，抽吸法吸取直径 2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培养皿中，挑选裸卵、半裸卵及具有3层及其以上卵丘的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs）用于试验。 　　1.3卵母细胞分级标准 　　根据包被卵母细胞的卵丘细胞完整性、卵丘细胞层数以及卵母细胞的胞质均匀性将卵母细胞分为4级：A级，卵丘细胞3层以上，胞质均匀；B级，1～2层卵丘细胞，胞质均匀；C级，裸卵，卵丘细胞不完整；D级是死亡或退化的卵母细胞。A、B级卵母细胞为可用卵母细胞。 　　1.4卵母细胞体外成熟培养 　　将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40～60个移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5 ℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23～24 h。若卵丘细胞共培养则用微滴法（100 μL），以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志[5]。 　　1.5卵母细胞的体外受精 　　受精液为IVF-100或BO液时运用直接离心法对精子进行洗涤，即用6 mL洗精液稀释解冻的精液并于2 000 r/min下离心7 min，弃去上清液，重复1次后用受精液稀释精子，密度为1×106～6×106 个/mL，然后放入CO2培养箱中备用。受精液为TALP液时则用上浮法对精子进行30～60 min的孵化，然后再离心洗涤。将23～24 h成熟的卵母细胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管将卵丘细胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蜡油的50 μL受精微滴中，加入50 μL精液后于CO2培养箱中进行受精。IVF-100受精时间为6 h，BO液受精时间为8 h，TALP液受精时间为18 h。 　　1.6卵母细胞体外成熟判定 　　卵丘-卵母细胞成熟培养22～24 h后，主要通过在显微镜下观察卵母细胞的形态来判断卵母细胞是否成熟。正常成熟的卵母细胞细胞质均匀，