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人附红细胞体感染小鼠外周血白细胞凋亡的研究 　　[摘要] 目的 了解人附红细胞体感染对小鼠白细胞凋亡的影响。方法 用流式细胞仪对白细胞凋亡以及CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞亚群的动态变化规律进行检测。结果 感染后CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞比例下降，CD4+ T 淋巴细胞比例在感染后第3天和第5天分别由感染前的12.89% 下降到10.83% 和6.34%，CD8+ T 淋巴细胞比例由感染前的8.31% 分别下降到6.16%和4.32%。白细胞凋亡的检测显示， 感染初期感染组凋亡细胞显著高于对照组。结论 人附红细胞体诱导细胞凋亡是导致免疫抑制和免疫细胞减少的主要原因。 　　[关键词] 人附红细胞体；小鼠； 白细胞； 细胞凋亡 　　[中图分类号] R725；S858.28 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0007-03 　　附红细胞体（Eperythrozoon）是寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中的一群微生物，能导致人和动物的附红细胞体病（Eperythrozoonosis）。自1928年Schilling和Dinger 等分别在啮齿类动物中查到该病原体后，迄今全世界已有30多个国家和地区对此报道。近几年，学者主要对附红细胞体所寄生的红细胞及红细胞免疫学方面研究较多[1]，而未发现有关人附红细胞体对白细胞影响变化的报道。为了解人附红细胞体感染后宿主机体免疫情况的变化，本实验对人附红细胞体感染小鼠后外周血白细胞变化、白细胞凋亡的变化及CD4+和CD8+T 淋巴细胞亚群变化进行检测，为进一步研究人附红细胞体感染人群附红细胞体病提供理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物和主要试剂 　　SPF级BALB/c小鼠，购自泰山医学院实验动物中心，共36只，雌雄各半，6～8周龄，体重22～24 g。人附红细胞体阳性血液通过医院确诊的人附红细胞体感染阳性的患者采取；从美国罗氏公司购买的ACTGene Annex in V-FITC细胞凋亡试剂盒；从美国BD公司购买的用荧光标记的CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体。 　　1.2 样品采集 　　将36只小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只，隔离饲养。实验组经腹腔接种附红细胞体悬液0.5 mL/只，对照组经腹腔接种生理盐水0.5 mL/只，分别于感染第1、3、5、7、9天经心脏取血，肝素抗凝。 　　1.3 外周血白细胞及白细胞凋亡检测 　　采集的抗凝血用BC-2000血液细胞分析仪检测白细胞总数量。根据细胞凋亡试剂盒说明书使用程序，用Annex in V-FITC和PI双试剂对白细胞进行染色，通过流式细胞仪双通道检测荧光信号[2]。 　　1.4 CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群检测 　　按照检测试剂和仪器说明书，应用流式细胞术检测。取肝素抗凝血样本100 μL分别加入CD3+、CD4+和CD3+、CD8+单克隆抗体对照10 μL，室温避光孵育30 min，加入溶血素溶解红细胞后，1500转/min，离心5 min， 弃上清，用PBS 重新悬浮细胞，过滤网过滤样本后上机检测[3-4]。 　　1.5 统计学方法 　　应用SPSS13.0软件包进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 白细胞总数的变化 　　感染后实验组小鼠外周白细胞总数量显著减少，白细胞总数量平均值由感染前的4.95×109/L，下降到感染后第5天的3.27×109/L，与感染前比较差异显著（P0.05）。感染后第9天减少至2.89×109/L，仅为感染前的白细胞总数的58.4%，与感染前比较，差异显著（图1）。对照组白细胞总数在实验前后没有明显变化。 　　图1 人附红细胞体感染小鼠白细胞总数的变化 　　2.2 白细胞凋亡的变化 　　对实验组和对照组小鼠白细胞进行凋亡检测，实验组在感染后第3天和第5天，小鼠白细胞凋亡的比例显著高于对照组，特别是在第5天，实验组小鼠白细胞凋亡数占细胞总数平均值8.17%，对照组小鼠白细胞凋亡数平均值1.2%，差异有统计学意义（P0.05）。在第7、9天，实验组与对照组白细胞调亡数白细胞总数比较不显著。 　　2.3 CD4+、CD8+ T淋巴细胞的变化 　　分别在感染后第3、5、7、9天采集外周血，检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞的变化。结果是感染前实验组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞数占T淋巴细胞总数的百分比分别为12.89%和8.31%，感染后百分比逐渐降低。在第3天，CD4+、CD8+ T淋巴细胞显著减少，分别下降到10.83%和6.16%；感染后第5天，分别为6.34%和4.32%。但在感染后第7天，CD4+、CD