中药提取液在大鼠附睾精子冷冻保存中应用效果.docVIP

中药提取液在大鼠附睾精子冷冻保存中的应用效果 　　摘要：对菟丝子、淫羊藿水提液进行分离纯化，并将水提液加入大鼠精液冷冻保护剂中，对大鼠附睾尾部精子进行冷冻保存，并评估冷冻前后精子活率指数，采用伊红染色评估精子畸形率。结果表明：添加菟丝子、淫羊藿水提液的冷冻保护剂可以提高解冻后精子活率指数。菟丝子、淫羊藿水提液在大鼠精液冷冻保存过程中有一定的保护作用。 　　关键词：淫羊藿；菟丝子；大鼠；附睾精子；精子活率指数 　　中图分类号： R321.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0145-03 　　精液冷冻保存技术已有200多年的历史。人的精液冷冻保存可以追溯到20世纪40年代末。目前，精液冷冻保存在我国主要应用于人类精子库，目前，已经建立了较为成熟的精液冷冻保存体系。全国各生殖中心对人精液冷冻保护剂的需求量比较大，市场上人精液冷冻保存剂几乎全部被国外的生物公司所垄断，国内只有部分科研院所自行配制畜禽精液冷冻保护剂，还没有我国自行开发的人类精液冷冻保护剂应用于临床。笔者前期研究表明，对少弱精患者进行精液冷冻保存，可以获得尽可能多的处理后活动精子总数（PTMS），并应用于宫腔内人工授精（IUI），使更多的患者可以接受IUI技术治疗，减少治疗费用，让不孕不育患者以最小的代价获得妊娠[1]。现有的人类精液冷冻保存系统适合人的正常精液。本研究探讨中药水提液对大鼠精液冷冻保存效果，旨在为冷冻保存少弱精患者精液提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　15周龄清洁级SD雄性大鼠（南京医科大学实验动物中心），取附睾精子用于冷冻保存研究。菟丝子（安徽井泉集团中药饮片有限公司），批号淫羊藿（安徽省万生中药饮片有限公司），批号2种药材均购自江苏省中医院药剂科。M16 Medium（Sigma公司），批号：11A832。 　　1.2 方法 　　1.2.1 菟丝子、淫羊藿中药提取液的制备 取干净菟丝子、淫羊藿各500 g，分别加8倍蒸馏水（4 000 mL）浸泡30 min，武火煮沸，文火再煮30 min，滤布过滤，滤渣再加5倍量水（2 500 mL），同上法再处理2次，各煮沸30 min，合并3次滤液。将合并的滤液旋蒸，浓缩至1 000 mL。将浓缩液置于冰箱中静置沉淀，去除悬浮粒子（24 h）。将菟丝子滤液于70 ℃水浴中浓缩至 1 g/mL （每mL药液相当于1.00 g生药量），淫羊藿滤液浓缩至 2 g/mL （每mL药液相当于2.00 g生药量）。将浓缩滤液 2 500 r/min 离心20 min，取上清液 200 mL，加入等量蒸馏水稀释后过夜，2 500 r/min离心 20 min 后再30 000 r/min高速离心20 min，提取上清液最终定量为菟丝子0.5 g/mL（每mL药液相当于0.50 g生药量），淫羊藿滤液浓缩至1.00 g/mL（每mL药液相当于1.0 g生药量）。将上清液经0.45 μm滤器过滤，冷藏保存备用。 　　1.2.2 固体物质含量测定 取菟丝子、淫羊藿水提取液各 2 mL，置恒重的称量瓶中，于120 ℃电热恒温干燥箱中干燥 3 h，使溶液缓慢挥发，直到其中的固体成分完全干燥为止，准确称量，重复2次，取平均值。溶液固含量计算见公式（1）： 　　固含量=干燥后固体重量/溶液总重量×100% 　　（1） 　　1.2.3 稀释液的配制 375.0 mmol/L Tris（51.11 mg/mL）+124.0 mmol/L柠檬酸（26.06 mg/mL）+41.0 mmol/L葡萄糖（8.12 mg/mL）。50 mL稀释液含2.555 5 g Tris+1.303 g柠檬酸+0.406 g葡萄糖。用375.0 mmol/L Tris将稀释液的pH 值调整到7.0，用三蒸水将渗透压调整到375 mOsm。 　　1.2.4 基础液的配制 基础液Ⅰ：M16培养液+50 μg/mL硫酸链霉素+75 μg/mL青霉素+0.1 mol/L棉籽糖+0.05% SDS+20%卵黄（95%）。基础液Ⅱ：首先自行配制mKRB培养液，配方如下：CaCl2?2H2O 1.71 mmol/L，MgSO4?7H2O 119 mmol/L。KCl 4.78 mmol/L、KH2PO4 1.19 mmol/L、NaHCO3 25.07 mmol/L、NaCl 94.6 mmol/L、葡萄糖 5.56 mmol/L、丙酮酸钠 0.5 mmol/L、乳酸钠 21.58 mmol/L、硫酸链霉素 50 μg/mL、青霉素 75 μg/mL。在mKRB培养液中一次性加入01 mol/L棉籽糖、005% SDS、20%卵黄。基础液Ⅰ、基础液Ⅱ加入卵