人结直肠癌BRAF基因V600E突变检测方法.docVIP

人结直肠癌BRAF基因V600E突变的检测方法 　　摘要：为了探讨人结直肠癌BRAF基因V600E突变的检测方法，文章通过等位基因特异性扩增技术检测80例结直肠癌石蜡标本的BRAFV600E突变性，且与Sanger测序法进行对比，得出结论：通过等位基因PCR技术检测人结直肠癌BRAF基因V600E突变，与测序法对比灵敏度、简便性、快速性更高，对人肿瘤BRAFV600E突变具有较高的筛查价值。 　　关键词：人结直肠癌；等位基因；特异性扩增；BRAF基因；V600E突变 文献标识码：A 　　中图分类号：R735 文章编号：1009-2374（2016）24-0072-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.24.036 　　目前，临床中有超过30种BRAF突变类型，大约90%突变处在第15外显子，而V600E突变则是最为常见的一种突变。本文将人BRAF基因V600E突变位点作为等位基因特异性扩增引物，经等位基因特异性扩增技术检测且与金标准Sanger测序法，分析其可行性。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选用的人大肠癌SW480、HT29细胞均通过测序显示为BRAF野生型、携带BRAFV600E杂合突变。80例结直肠癌标本均由医院病理科提供。其DNA肿瘤组织切片通过镜检显示肿瘤细胞水平超过90%。 　　1.2 方法 　　提取DNA，并将模板DNA放置到-20℃环境内保存。等位基因特异性扩增法：将人大肠癌细胞株SW480、HT29与80例肿瘤标本予以等位基因特异性扩增，PCR体系总体积是20μL ，含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有0.5μL（10μmol），模板DNA30ng，置入灭菌去离子水达到20μL。通过95℃预变性30s；95℃变性10s；67℃退火20s；72℃延伸30s，总45个循环进行反应。将肿瘤标本取出1μL进行第一次扩增，并将其产物用作二次扩增物，采用同样扩增方法。将PCR产物采集5μL实施琼脂糖（2%）凝胶电泳，持续30min，然后予以显像。 　　标本与细胞株均通过PCR测序且对比等位基因特异性扩增的结果。PCR反应条件为：含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有1μL（（10μmol），模板DNA30ng，置入灭菌去离子水达到20μL。通过95℃预变性30s；95℃变性10s；54℃退火20s；72℃延伸30s，总40个循环。将PCR产物通过琼脂糖（2%）凝胶电泳显示目的条带扩增完成后进行测序。 　　采集SW480、HT29细胞株DNA，通过核酸定量仪进行定量，达到30ng，依据一定比例通过携带BRAF野生型（SW480）的核酸与包含BRAFV600E突变（HT29）的核酸相混合，获得包含50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突变DNA混合模板，然后再分别采集30ng实施等位基因特异性扩增，且对比普通PCR后测序的灵敏度。 　　2 结果 　　BRAF基因V600E突变结果经PCR条件反应，能够选择扩增出携带有BRAF基因V600E杂合突变的细胞株。80例大肠癌石蜡标本中，6例形成目的扩增产物。通过测序，74例BRAF基因15外显子1799位核苷酸是野生型，6例为BRAF基因V600E突变，此结果与等位基因特异性扩增具有一致性。经等位基因特异性扩增的不同比例突变核酸，此法可于6.2%突变基因模板内扩增目的条带，BRAF基因V600E突变的敏感度可低到6.2%。普通PCR后测序结果自峰图显现50%、25%、12.5%的突变位点，比12.5%低的与背景信号相混杂难以测出。 　　3 讨论 　　恶性肿瘤使得人类生命健康受到严重威胁，且有日益突出的趋势，寻找较为有效的，可以在早期对其进行诊断治疗的方法在医学领域已逐渐成为较为重要的研究课题，是基础与临床医学研究的热点项目。肿瘤细胞在基因组水平上与正常体细胞具有比较高的差异，是肿瘤演变及生长过程中出现稳定复制的一类具有较高重要性的驱动突变，可用作新的生物标志物，对于肿瘤的临床诊断与预后评判具有重要意义。 　　BRAF基因编码蛋白是丝裂原活化蛋白激通路中?A一种丝苏氨酸特异性激酶，是通路中的一个重要转导因子。目前BRAF基因检测方法主要有探针扩增阻滞突变系统（ARMS）、测序法、高分辨率溶解曲线分析技术（HRM）、限制性片段长度多态性（RFLP）、单链构象多态性分析（SSCP）和高效液相色谱法（DHPLC）等方法。BRAF基因V600E为此基因的热点突变，表现是T变为A，突变后使得编码的谷氨酸被缬氦酸所代替。对结直肠癌患者进行靶向治疗过程中显示，携带有突变使得患者使用EGFR单抗药物（