[实验三]DNA限制性酶切.pptVIP

实验二、DNA限制性酶切 一、DNA限制性内切酶介绍 限制性内切酶是指能特异性结合于一段被称为限制性识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。 DNA限制性内切酶可分成三类： I类酶：结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA。 Ⅲ类酶：在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。 以上二类酶兼有切割和修饰（甲基化）的作用，并且依赖于ATP的存在。 II类酶由二种酶分子组成的二元系统，一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。至今已分离出600多种II类酶。限制性内切酶在分子克隆中得到广泛应用，是重组DNA的基础。 大多数II类限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，如 coR I: 5’- GAATTC-3’; HindIII: 5’-AAGCTT -3’; BamH1: 5’- GGATCC-3’; Sau3A I: 5’-GATC-3’. 一、DNA限制性内切酶介绍 II类限制性内切酶的切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端DNA片段，如Sma I: 5’--- CCC GGG ---3’; 有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段，称为粘性末端. 如EcoR I: 5’--- G AATTC----3’ 5’---G AATTC---3’ 3’ ---CTTAA G —5’ 3’---CTTAA G---5’ ? 各种限制性内切酶的酶解反应条件各不相同，各种酶有相应的缓冲液和反应温度（大多为37℃）。1单位酶的定义为：在合适缓冲液和反应温度下，在20ul反应体积中一小时内完全降解1?g DNA 所需要的量。 二、RFLP（限制性片段长度多态性） RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性)，多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。 所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状(基因)与某个(些)分子标记协同分离时，表明这个性状(基因)与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。 不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindlII，BamHI，EcoRI，EcoRV,XbaI，而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。 2．RFLP（限制性片段长度多态性） RFLP基本步骤： DNA的提取(尽可能大) 用限制性内切酶酶切DNA 凝胶电泳分开DNA片段 把DNA片段转移到滤膜上 利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交） 结果分析。 三、限制性内切酶酶切实验步骤 1. 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管用移液枪分别加入DNA1?g和相应的限制性内切酶反应10?缓冲液2?l, 再加入重蒸水使总体积为19?l, 将管内溶液混匀后进入1?l酶液，用手指清弹管壁使溶液混匀，用离心机甩一下，使溶液集中于管底。 2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2?l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10?l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。 * 图右表示了植物A叶绿体基因组小部分DNA的限制图以及植物A和另外2个材料(B和C). 的RFlP形式．如果植物A与祖先种相比变化很小，那么假定它发生了2个突变．突变1，在13Kb片段上出现一新的限制性位点，产生9Kb和4Kb的片段．突变2，在形成植物C的过程中，一个限制性位点消失，产生UKb片段，6Kb和5Kb的消失．基于这一系列变化，就可列出系统发育图(图左). *