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刺猬紫檀木材DNA条形码鉴定研究 　　摘 要：该文以采自不同产地的刺猬紫檀木材为研究对象，提取并扩增核ITS2、叶绿体matK基因及叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32，采用BLAST和NJ树法评价不同DNA条形码候选序列的鉴定能力。结果表明，ITS2序列具有最高的扩增和测序效率，ITS2序列的平均种间遗传距离也明显高于种内遗传距离。ITS2序列可以将刺猬紫檀木材与其他同属近缘紫檀属树种木材区分开来。 　　关键词：刺猬紫檀；DNA条形码；木材识别 　　中图分类号 S781 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）05-0023-03 　　刺猬紫檀（Pterocarpuserinaceus Poir.）为豆科紫檀属大乔木树种，主要分布于西非国家，是我国红木标准（GB/T18107-2000）中5属8类33种红木树种之一。刺猬紫檀的叶片、树皮和树根均具有重要药用价值，其内含提取物具有治疗慢性腹泻、抗疟疾和治疗肠道寄生虫感染等功效[1]。刺猬紫檀常被用来制作高档家具和工艺品，深受消费者喜爱和追捧。这也造成了刺猬紫檀砍伐量的激增，直接导致该树种野生资源日益枯竭。 　　传统的木材识别方法具有一定的局限性，难以将木材树种准确地识别到种的水平[2]。随着研究水平和检测手段的不断发展和进步，在传统的木材识别技术的基础上，其他领域的分析方法开始尝试应用到木材识别和鉴定中，极大地丰富了木材识别与鉴定的手段[3]。目前，国内采用红外光谱技术对于刺猬紫檀及其近缘种树种木材的识别研究较多[4-6]，但采用DNA条形码技术识别刺猬紫檀木材的研究还未广泛开展。为此，本研究以采自不同产地的刺猬紫檀木材为研究对象，提取并扩增核ITS2、叶绿体matK基因及叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32，并采用BLAST和NJ树法评价不同DNA条形码候选序列的鉴定能力，以期为利用DNA条形码技术准确地识别刺猬紫檀及其近缘种木材提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 本研究刺猬紫檀木材试样分别产自非洲西部7个不同的国家，样品信息和产地来源见表1。所有木材试样在进行DNA提取前均需用无菌刀片切除木材表面部分，并将木材试样切成小片置于冷冻研磨仪中低温制备成粉末后备用。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA提取及纯化 称取500mg木材粉末置于50mL无菌离心管中，使用DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Maxi Kit，QIAGEN）提取木材总DNA。木材DNA纯化采用PCR扩增模板纯化试剂盒（High Pure PCR Template Preparation Kit，Roche）纯化DNA提取物。 　　1.2.2 DNA条形码序列的扩增、产物纯化及克隆测序 通过比较和分析GenBank已公布的紫檀属细胞核ITS2、叶绿体matK基因和叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32，设计3对DNA条形码序列扩增引物。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。3条DNA条形码序列扩增引物信息和反应体系见表2。PCR产物特异性通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit（全式金）进行胶回收纯化回收，纯化回收后的DNA条形码片段克隆采用pEASY-T1 Simple Cloning Kit（全式金），并在固体LB平板中进行培养和蓝白斑筛选。将鉴定为阳性克隆重组子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，为保证测序结果准确性，每个样品选择5个独立的克隆重组子进行双向测序。 　　1.2.3 DNA条形码序列的分析 测序结果采用Lasergene Suite 7软件进行正反向序列校对和拼接，去除引物两端载体序列。采用MEGA 5.0软件的Kimura two parameter（K2P）模型进行DNA条形码种间和种内遗传距离计算，统计序列的碱基组成、变异位点和信息位点等序列特征信息。采用BLAST方法对获得的DNA条形码序列在GenBank数据库中进行相似性同源搜索。将GenBank中与刺猬紫檀DNA条形码序列同源性序列较高的同属其他种序列（见表3）与本研究获取的DNA条形码序列一起采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，系统发育树各分支的置信度用自举检验法（boot-strap text）作1000次可信度分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 PCR扩增和测序成功率 3条DNA条形码候选序列的PCR扩增和测序成功率结果如图1所示。由图1可知，ITS2序列PCR扩增成功率最高为93%，叶绿体基因间隔序列ndhF-rpl32最低为79%。核ITS2序列多拷贝存在于核基因组中，这可为降解为小片段的DNA扩增提供有利的条件和保