食品中动物性成分检验方法－狗成分之定性检验.DOC

食品中動物性成分檢驗方法－狗成分之定性檢驗 101年3月2日署授食字第1011900798號公告訂定 1. 適用範圍：本檢驗方法適用於狗肉、狗血及其組織之定性檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經DNA萃取後，以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）及即時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）之方法。 2.1. 工作環境：工作平台需寬敞、潔淨、光線良好。檢體前處理、檢體DNA抽取、PCR試劑配製及PCR等檢驗過程皆需有區隔空間，避免交叉污染。PCR試劑之配製應於無菌操作台內進行。 2.2. 裝置（註1） 2.2.1. 聚合酶鏈反應器：ABI PRISM 9700 Sequence Detector，或同級品。 2.2.2. 即時聚合酶鏈反應器（註2）：ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System或Roche LightCycler，或同級品。 2.2.3. 冷凍乾燥裝置：溫度可達 -40℃以下，真空度可達133 mBar以下，供檢體乾燥用。 2.2.4. 振盪型粉碎機：Retsch MM200，或同級品。 2.2.5. 真空乾燥裝置：供DNA乾燥用。 2.2.6. 高壓滅菌釜。 2.2.7. 無菌操作台。 2.2.8. 加熱振盪器：具55℃溫控及振盪功能。 2.2.9. 微量冷凍離心機（Micro refrigerated centrifuge）：可達20000 × g，並具4℃溫控功能。 2.2.10. 離心機：供各式微量離心管離心用。 2.2.11. 分光光度計：具波長260 nm、280 nm。 2.2.12. 冷凍設備：具冷藏及凍結功能。 2.2.13. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 2.2.14. 電泳槽：供DNA電泳用。 2.2.15. 照相裝置：供拍攝電泳膠片用。 2.2.16. 紫外燈箱：具波長302 nm、365 nm紫外燈。 2.2.17. 酸鹼度測定儀（pH meter）。 2.2.18. 水浴裝置：溫差 ±1℃以內者。 2.2.19. 天平：最大稱重量為2000 g，靈敏度為0.1 g；最大稱重量為100 g，靈敏度為1 mg。 註1： 本方法所使用或提及之產品品牌不代表為同類產品中最好者；反之，未使用或提及之產品品牌亦不代表為同類產品中較差者。 註2： 確認試驗用。 2.3. 試藥 2.3.1. DNA抽取用試藥：乙醇（96-100%）採分子生物分析級試藥；適用於動物DNA抽取之市售套組。 2.3.2. PCR用（註3） 　2.3.2.1. 鑑別試驗用引子 　　2.3.2.1.1. 動物類（標的基因：16S ribosomal RNA，供作內部對照基因） 　　　　　　 引子F：SF, 5￠-AAGACGAGAAGACCCT(A/G)TGGA(A/G) CTTTA-3￠ 　　　　　　 引子R：SR, 5￠- GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3￠ 　　　　　　 PCR增幅產物大小256 bp 　　2.3.2.1.2. 狗（標的基因：short interspersed elements, SINEs） 　　　　　　 引子F：CanF, 5￠- AGGGCGCGATCCTGGAGAC-3￠ 　　　　　　 引子R：CanR, 5￠- AGACACAGGCAGAGGGAGAA-3￠ 　　　　　　 PCR增幅產物大小83 bp 　2.3.2.2. 確認試驗用引子及探針 　　2.3.2.2.1. 動物類（標的基因：16S ribosomal RNA，供作內部對照基因） 　　　　　　 引子F：SF, 5￠-AAGACGAGAAGACCCTRTGGAR CTTTA-3￠ 　　　　　　 引子R：SR, 5￠- GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3￠ 　　　　　　 探針P：SP, 5￠-(FAM)-TTYGGTTGGGGTGACCTCGG RGT-(TAMRA)-3￠ 　　　　　　 PCR增幅產物大小256 bp 　　2.3.2.2.2. 狗（標的基因：short interspersed elements, SINEs） 　　　　　　 引子F：CanF, 5￠- AGGGCGCGATCCTGGAGAC -3￠ 　　　　　　 引子R：CanR, 5￠- AGACACAGGCAGAGGGAGAA -3￠ 　　　　　　 探針P：CanP, 5￠-(FAM)- CACATCGGGCTCCCGGTGCAT -(TAMRA)-3￠ 　　　　　　 PCR