一．超分辨定位成像简介.PDFVIP

一． 超分辨定位成像简介 1. 基本原理 现代光学显微镜通常属于无穷远光学系统（Infinity Optical Systems ）范畴。因为衍 射的存在，点光源通过光学显微镜后所形成的像是一个有限大小的模糊光斑。人们公认， 光学显微镜的分辨率受入射光的波长以及物镜数值孔径的限制。对于横向分辨率，较为 常用的一个公式为：r = 0.61/NA 。若考虑入射光波长为 500 nm, 物镜数值孔径 NA 为 1.5 ，介质折射率n 为 1.515，可计算得到光学显微镜的横向分辨率极限约为200 nm 。 然而，利用单分子定位技术，对充分分离的衍射斑进行发光中心定位，可以准确地 找到分子的中心位置1 。随着单分子荧光显微成像和单分子定位的发展、以及可控光激 活荧光蛋白和光切换染料的发明，旨在突破衍射极限的超分辨定位成像方法应运而生。 2006 年，三个实验室通过不同方法控制荧光探针的发光状态，均达到了超分辨成像的 效果。并将这一技术分别命名为光激活显微成像（Photoactivation localization 2 ，荧光光激活显微成像（Fluorescent photoactivation localization microscopy ，PALM ） microscopy ，fPALM ）3 和随机光学重构显微成像（Stochastic optical reconstruction 4 。除了所使用探针的差异，上述四种方法具有相同的原理（单 microscopy ，STORM ） 分子定位和重建），并且最终都能达到约 20 nm 的空间分辨率，因此后来被统称为超分 辨定位成像（Super-resolution localization microscopy）。 要得到最终的超分辨定位图像，首先需要利用光激活/光切换的荧光探针标记感兴 趣的研究结构。成像过程中，利用激光对高标记密度的分子进行随机稀疏点亮，进而进 行单分子荧光成像和漂白；不断重复这种分子被漂白、新的稀疏单分子不断被点亮、荧 光成像的过程，将原本空间上密集的荧光分子在时间上进行充分的分离。随后，利用单 分子定位算法对采集到的单分子荧光图像进行定位，可以准确得到分子发光中心位置； 最后，利用这些分子位置信息，结合图像重建算法，获得最终的超分辨图像。不难理解， 超分辨图像质量的关键在于二点：一是找到有效的方法控制发光分子的密度，使同一时 间内只有稀疏的荧光分子能够发光；二是高精度地确定每个荧光分子的位置。 具有纳米尺度分辨率的超分辨定位显微镜的出现，使得人们在更高精度进行生物研 究成为现实，为在分子水平上进一步揭开生物学奥秘提供了技术手段，并且在蛋白质网 络结构、DNA等遗传物质、细胞器以及膜结构等研究中有了具体应用。在神经科学领 域，超分辨定位成像技术同样值得关注：2010 年哈佛大学庄小威课题组在Neuron上发 表文章，利用多色三维STORM，揭示了十种突触前和突触后蛋白在纳米尺度上的三维 分布5 ；2012 年Plos One 的一篇文章，基于三维多色STORM，高精确度的实现了神经元 6 追踪 。 2. 成像系统 以广泛使用的荧光蛋白 EosFP 为对象，超分辨定位成像系统的典型配置如图 1 所 示。该装置基于倒置的 Olympus IX 71 显微镜，配备了数值孔径为 1.49 的 100 倍 TIRF 油镜（UAPON 100XOTIRF, Olympus ）以满足荧光信号的收集效率。405 nm 激光器 （DL405-050, CrystaLaser ）和561 nm 激光器（CL561-150, CrystaLaser)分别被用作 EosFP 蛋白的激活光和激发光。中性滤光片（ND1 和 ND2 ）用于控制入射到样品上的光功率， 被放置于激光器的出光口附近；快门（SH1 和 SH2，UNIBLITZ VS14, Vin