兽医药理学实验17-2.ppt

抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）的测定 兽医学院实验教学中心 掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物MIC的基本步骤，能准确测出各种抗菌药物的MIC值，了解单药的抗菌活性； 为后面棋盘法设计棋盘做准备，求取棋盘法的中心浓度。 实验目的 1 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）：药物在培养基中通过连续两倍稀释，眼观可见待检测细菌在培养基中生长受到抑制的最低浓度即为该药的最小抑菌浓度。 实验原理 2 实验材料 ３ 【实验药品及菌株】　 1.药品 氨苄西林（中国药品生物制品检定所，含量：86％） 阿米卡星（齐鲁制药有限公司， 效价：650u/mg） 四环素（中国药品生物制品检定所，含量：95%） 粘菌素（中国药品生物制品检定所，含量：99.5％） 实验材料 ３ 【实验药品及菌株】　 2.培养基 MH营养肉汤、LB营养肉汤、麦康凯琼脂 生理盐水 3. 菌株 大肠杆菌标准菌株ATCC25922，由中国兽医药品监察所提供。 【实验器材】 96孔细胞培养板、移液枪1mL、200μl 各一支、枪头1mL、200μl、小试管、锥形瓶、试管架、酒精灯、平皿、酒精棉; 分析天平、自动高压灭菌锅、超净工作台、37℃恒温培养箱。 实验材料 ３ 在96孔板的前三排即A/B/C三排每孔中各加入空白肉汤100μL 实验步骤 ４ 空白肉汤100μl 药液100μl 空白肉汤100μl 空白肉汤100μl 空白肉汤100μl 空白肉汤100μl 取100μl 弃去100μl 2. 在A/B/C三排的第1孔加配好的药液(浓度为512单位/mL或μg/mL)100μl，然后对药物进行二倍稀释。此时每孔药物浓度从左到右依次为(单位:IU/mL或μg/mL)： 256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125 再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl,这样就形成测定一个药物MIC值的三次重复（A/B/C三排样品）。此时每孔药物浓度即最终药物浓度从左到右依次为(浓度: 单位/mL或μg/mL)： 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06 另外在同一块板上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和一排阳性对照（加菌液肉汤不加药液）； 将96孔板放入37℃恒温培养箱培养16~20小时后，观察结果。 操作完成后放于培养箱中培养16-24小时 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A ①100μL肉汤 ②100μL药物 最后加100μL菌液 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL B 同A C 同A D 步骤同A， 更换药物 E 同D F 同D G 阳性对照100μL肉汤+100μL菌液 H 阴性对照200μL肉汤 无菌操作 所有用具都需经过灭菌处理。 超净台使用前后都需用新洁尔灭擦拭，开紫外灯进行消毒；不能拿酒精棉球擦挡板。 操作前，用酒精棉球擦手。 每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；移液枪和枪头不准在酒精灯上烤！ 操作过程中尽可能不将96孔板盖完全打开 。 注意事项 5 移液器的使用 调刻度。 不倒立。 准确吸取液体。 换枪头。 3、其他注意事项 培养板上做好标记（班级、姓名、时间、药物名称及浓度）。 每药做三个重复，每个板做一个阴性对照和一个阳性对照。 超净台内用过的不需要的东西都必须放到废液缸内。 实验完后要收拾好台面。 注意事项 5 【结果判定】 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。 实验结果 6 表1 四种药物对大肠杆菌的MIC值（μg/mL或IU/mL） 受试菌株 药物（μg/mL或IU/mL） 氨苄西林 阿米卡星 四环素 粘菌素 大肠杆菌 【结果列表】 作业 7 讨论微量肉汤二倍稀释法应注意哪些环节才能准确测定MIC？ MIC试验对临床选药的意义以及它的局限性？