同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞中PTEN甲基化影响.docVIP

同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞中PTEN甲基化影响 　　摘要：目的 探讨同型半胱氨酸（homocysteine， Hcy）磷酸酶与张力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN）启动子区DNA甲基化的影响。方法 原代培养血管平滑肌细胞（VSMCs），100 M Hcy刺激48h后，以实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测PTEN mRNA 表达水平的变化，western blot检测PTEN蛋白表达变化；生物信息学分析PTEN启动子区CpG岛，巢式降落时甲基化特异性PCR（nMS-PCR）检测PTEN DNA甲基化水平。结果 与正常对照组相比（0 M Hcy），给予100 M Hcy刺激后，VSMCs中PTEN mRNA 及蛋白表达水平均降低；其启动子区存在数个CpG岛，其DNA甲基化水平升高。结论 Hcy可下调VSMCs中PTEN的表达，而PTEN DNA启动子区的高甲基化可能在这一过程中起到关键调控作用。 　　关键词：同型半胱氨酸；PTEN；DNA甲基化；血管平滑肌细胞；动脉粥样硬化 　　血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖等改变是动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心环节。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是AS的独立危险因子[1]，可以促进VSMCs的增殖[2]。磷酸酶与张力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN） 在细胞的生长、存活、迁移、分化等过程中发挥了重要作用。但Hcy是否通过影响PTEN DNA甲基化影响其在血管平滑肌细胞的表达目前未见报道。本研究用Hcy干预VSMCs，检测PTEN mRNA、蛋白表达其启动子区 DNA甲基化水平，为今后研究Hcy导致AS的发生发展机制打下基础。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 原代人脐静脉平滑肌细胞由本实验室培养；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自Hyclone公司；逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Fermentas公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；DNA抽提试剂盒购自北京百泰克；DNA甲基化修饰试剂盒购自美国ZYMO RESEARCH；兔抗人PTEN抗体、兔抗β-actin、辣根酶标记羊抗兔IgG 购自北京博奥森生物科技有限公司。 　　1.2方法 　　1.2.1原代细胞人脐静脉平滑肌细胞培养与鉴定 采用于海娇[2]等方法培养及鉴定原代培养的人脐静脉平滑肌细胞。 　　1.2.2荧光定量PCR检测PTEN mRNA的表达 将上述转染pEGFP-PTEN的细胞用TRIzol法提取总RNA并反转录为c-DNA行荧光定量PCR检测PTEN mRNA的表达。以GAPDH为内参照，根据PCR仪自动生成的Ct值，根据公式计算目的基因的相对量：相对表达量=2-△△Ct。 　　1.2.3 western blot检测PTEN 蛋白的表达 按照全蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白进行SDS电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST 洗膜；1：500 稀释的抗PTEN 蛋白抗体，1：1000 稀释的抗β-actin抗体 4℃孵育过夜，TBST洗膜；辣根过氧化物酶（1：3000）室温标记1 h，TBST洗膜；凝胶成像系统分析，以β-actin 蛋白为内参，用PTEN与β-actin条带像素灰度的比值表示PTEN 蛋白的相对表达量。 　　1.2.4巢式降落式甲基化特异性 PCR（nMS- PCR）检测PTEN启动子区 DNA 甲基化程度 根据DNA 提取试剂盒说明书提取基因组 DNA，用亚硫酸盐修饰法对 DNA 进行修饰，设计外引物及甲基化引物（M）及非甲基化引物（U），PTEN外 引 物 上 游：5-TTGGAAAGTTTTTT AATTAGGGATA-3， 下游：5- TTTCAAAAACCCAAA AAACAC-3，产物长度为445bp；M上游：5-GTGATTTTT TTCGGAAAGTAGTTTC-3，下游：5-TAAAAACC CGACAAA ATAAATCG-3；U上游：5-ATTTTT TTTGGAAAGTA GTTTTGA-3，下 游：5-AAAACCCA ACAAAATAAATCACC-3。甲基化产物为211bp，非甲基化产物为207 bp，反应后取终产物在2%琼脂糖凝胶电泳，分析光密度，按如下公式进行结果的计算：甲基化（%）=OD甲基化/OD甲基化+OD非甲基化]。 　　1.3统计学分析 结果以x±s表