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南果梨叶片离体培养高效再生体系 　　摘要：为探索一种南果梨叶片离体培养高效再生的方法，以南国梨离体培养试管苗叶片为材料，在MS基本培养基中添加6-BA、NAA、IAA进行离体培养，系统地研究植物生长调节物质浓度、苗龄、不同部位叶片、接种方向、温度、pH值及光照强度对南国梨叶片离体培养再生的影响。结果表明，MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+ 7 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖为南国梨叶片再生芽诱导的适宜培养基，诱导率最高，为46.1%；选择25～35 d苗龄叶片、近叶柄处远轴面向上叶片可获得高再生频率；南果梨叶片离体再生的适宜条件为：温度（25±2） ℃，pH值为5.8～64，高光照强度。 　　关键词：南果梨；叶片再生；离体培养；影响因素 　　中图分类号： S661.204+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0044-03 　　南果梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）属于蔷薇科（Rosaceae）梨亚科（Pomaceae）梨属（Pyrus L.）植物[1]，是秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）中优良的地方品种之一[2-3]。该品种果实色泽鲜艳、果肉细腻、爽口多汁，风味香浓，深受人们欢迎，市场发展前景十分广阔[4]。但南国梨果实成熟集中，不耐储运，柜台寿命短，限制了南国梨的发展。常规育种过程相对较慢，难以解决此问题。随着农业生物技术的发展，通过基因工程技术加快南国梨耐储品种的培育将成为解决南国梨保鲜的一条新捷径。而在转基因研究中，成功的基因转化首先依赖于高效稳定的再生系统。原生质体培养与叶片培养是目前运用最广泛的转基因植株再生系统[5]。叶圆盘法因能避免对原生质体的繁琐操作而成为基因转移中最常用的方法[6]。梨属植物叶片的再生已有报道[7-12]， 但未有南果梨叶片离体培养再生体系建立及其影响因素研究的报道。本研究以南果梨试管苗叶片为试材，建立高频稳定的叶片离体再生体系为目的，以MS基本培养基添加6-BA、NAA、IAA进行离体培养，系统地进行植物生长调节物质浓度、苗龄、不同部位叶片、接种方向、温度、pH值及光照强度对南国梨叶片离体培养再生影响的研究。本试验旨在研究叶片离体再生不定芽的影响因素，建立简单、快速、高效的叶片离体再生体系，从而为进一步利用基因工程技术对南国梨进行遗传改良提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　材料为采自辽宁省鞍山市的大红南果的一年生枝条，在无菌条件下培育出的试管苗。 　　1.2 方法 　　1.2.1 不同激素组合对叶片再生不定芽诱导的影响 取继代培养25～35 d的试管苗顶部生长健壮、完全展开的幼叶，将其放在无菌滤纸上，然后用解剖刀在叶片背面（远轴面）垂直中脉横划3刀，但不要完全切断叶片的上表皮。叶片再生芽诱导的基本培养基为MS培养基，不同激素组合见表1，附加蔗糖30 g/L，pH值5.8。培养温度为（25±2） ℃，每天光照 8～10 h，光照强度2 500～3 000 lx。叶片接种后50 d，调查叶片再生效率和再生芽数。 　　1.2.2 试验叶片的苗龄对不定芽诱导的影响 采用离体培养25、35、60、90、120 d组培苗叶片进行叶片苗龄对再生频率的影响研究。选取上部1～3叶位幼嫩叶片，垂直主脉横切2刀，将叶块近轴面向下接种于分化培养基上。 　　1.2.3 叶片种方方向对叶片再生不定芽的影响 设叶片远轴面和近轴面接触培养基2种接种方法处理，接种于MS+ 5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖培养基上，对比观察不定芽的诱导情况。培养及调查方法同“1.2.1”部分。 　　1.2.4 叶片不同部位对叶片再生不定芽的影响 取继代培养35 d的无菌苗叶片。在叶片的基部、中部和尖部垂直于中脉各切1刀，接种在筛选出的含适宜激素的不定芽诱导培养基（MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖）上，每瓶放3张叶片，重复8次。培养及调查方法同“1.2.1”部分。 　　上述试验均为每瓶接种9个叶块（3张叶），随机区组试验设计，每处理10瓶，重复3次。试验再生培养基为MS+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖。 　　1.3 结果调查与统计分析 　　在叶片接种30 d后对不定芽的再生率和平均每个叶块的分化不定芽数进行调查。结果用DPS统计软件进行方差分析，百分率经反正弦转换。再生频率=再生不定芽的叶块数/接种叶块数×100%；叶块平均再生芽数（个/叶块）=叶块再生不定芽总数/出芽叶块数。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同激素组合对叶片