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双抗夹心ELISA检测小鹅瘟病毒研究 　　摘要:采用双抗夹心ELISA方法快速检测样品中的小鹅瘟病毒。结果表明，该方法特异性较好，灵敏度可达0.7412μg/mL。该方法可以用于鹅细小病毒(GPV)的临床诊断及样品中有效抗原组分的检测，结果准确、快速、重复性好，且EL1SA效价与AGP效价具有相关性。 　　关键词:小鹅瘟;双抗夹心;ELISA 　　中图分类号:S854.4+3文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)10-0021-02 　　 　　小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起，主要侵害1月龄以内雏鹅的一种急性、高度接触性、败血性传染病，传染性强、病程短且死亡率高[1]。一般根据该病的流行特点、临床症状和病理解剖可作初步诊断，但是当有并发症存在时，该病的特征病变并不明显，需进一步进行实验室诊断[2~4]。目前常用的诊断方法有琼脂扩散试验(AGP)[5，6]、免疫荧光试验(FA)[7]、对流免疫电泳试验(CIE)[8]、聚合酶链式反应(PCR)[9]和酶联免疫吸附试验(ELISA)[10]等。ELISA以其敏感特异、快速简便等优点得到越来越广泛的重视和应用。本试验通过制备辣根过氧化物酶标记抗体，建立双抗夹心ELISA方法，旨在为GPV的实验室诊断及定量检测提供切实可行的方案。 　　1材料和方法 　　1.1毒株、血清 　　GPV毒株由本所分离鉴定，GPMV、DHV、DPV毒株均由本研究室提供;鹅源GPV高免血清(AGP效价1∶128)、鹅阴性血清均由本研究室提供。 　　1.2主要试剂 　　酶标羊抗兔IgG、弗氏完全佐剂均购自Sigma公司，TMB购自华美生物公司，新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，其他试剂均为分析纯。 　　1.3兔抗GPV免疫血清的制备 　　将GPV毒株经绒毛尿囊腔接种于12日龄易感鹅胚，收集48~60h死亡鹅胚尿囊液。按李茂祥等[11]的方法进行病毒纯化，经紫外吸收法测定病毒蛋白含量。将提纯的GPV病毒按比例与弗氏完全佐剂混合，皮下多点注射成年健康家兔，每隔10d后复免一次，直至AGP效价达1∶64后采集，与鹅阴性血清作用后保存备用。 　　1.4免疫球蛋白的提取 　　按周碧君等[3]的方法，采用硫酸铵盐析、凝胶过滤法和DEAE-离子交换纤维素法分别提取鹅源GPV高免血清和兔抗GPV免疫血清中的免疫球蛋白，经紫外吸收法测定其蛋白浓度。 　　1.5双抗夹心ELISA操作程序 　　①用CBS包被液将提纯的鹅抗GPV IgG包被于反应板，每孔100μL，4℃过夜后洗涤;②每孔加封闭液350μL，37℃作用2h后洗涤;③加入纯化的GPV抗原，每孔100μL，37℃作用1h后洗涤;④加入纯化的兔抗GPV IgG，每孔100μL，37℃作用1h后洗涤;⑤加入酶标羊抗兔IgG，每孔100μL，37℃作用1h后洗涤;⑥每孔加入底物溶液100μL，置暗盒内显色20min;⑦每孔加入50μL终止液，于450nm波长处测定各反应孔的OD值。 　　1.6最佳试验条件的确定 　　接常规程序进行下列条件筛选:鹅抗GPV IgG包被浓度(300，200，150，100，50，25μg/mL)、酶标抗体稀释倍数(1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000， 　　1∶6 000，1∶8 000，1∶10 000)、兔抗GPV IgG最适浓度(300，200，150，100，50，25μg/mL)。 　　1.7双抗夹心ELISA特异性测定 　　阻断试验:将GPV抗原分别与鹅抗GPV阳性血清、鹅阴性血清和兔抗GPV IgG及健康兔血清作用，4℃过夜，37℃孵育2h后，3 000r/min离心15min，取上清液检测，根据OD值变化判定其特异性;交叉试验:将GPV、GPMV、DHV、DPV及正常CEF培养液分别进行双抗夹心ELISA测定。 　　1.8双抗夹心ELISA敏感性测定及其与AGP的比较 　　将GPV毒株做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6系列稀释，分别进行双抗夹心ELISA测定和AGP试验。 　　1.9双抗夹心ELISA重复性测定 　　用建立的双抗夹心ELISA检测纯化的GPV病毒，重复3次。 　　1.10双抗夹心ELISA方法的初步应用 　　利用建立的双抗夹心ELISA方法与AGP方法对135份疑似样品进行检测。 　　2结果 　　2.1最佳试验条件的确定 　　经方阵滴定法测定，鹅抗GPV IgG的最佳包被浓度为200μg/mL，兔抗GPV IgG的最适浓度为100μg/mL，酶标羊抗兔IgG的最佳稀释度为1∶4 000。 　　2.2特异性测定 　　双抗夹心ELISA方法检测GPV的特异性试验结果