SUR1过表达实验设计方案3.docxVIP

SUR1过表达实验设计方案 一实验目的：使SUR1基因在植物体内超表达 二实验方法： 三实验步骤 RT-PCR将RNA反转录成CDNA RNA提取（-70℃保存） 组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停） 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min 10000 rpm 4℃离心15min 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min 12000rpm 4℃ 离心15min 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm 4℃ 离心5min 倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥 加20ul DEPC水至EP管中 在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解 逆转录 以Fernentas试剂盒为例，反应体系20ul RNA短暂离心 将11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5ug/ul,再加入Oligo(dt) 1ul,轻轻混合均匀，短时间离心 (RNA=1/总RNA浓度=1/ OD260×6 ；DEPC水=11-RNA) 将反应液置于65℃ 5min 冰上1min,短时间离心 按顺序加入： 5×buffer 4ul 200ul核糖核苷酸酶抑制剂 1ul 10mm dNTP MIX 2ul M-Mulu逆转录酶 1ul 轻轻混合均匀，短时间离心 将混合物置于42℃，60min 70℃加热5min,中止上述反应，置于冰上 据序列设计引物对CDNA进行PCR扩增 在TAIR上查出SUR1的序列 1 ATGAGCGAAG AACAACCACA CGCCAATCTA GCGGTTCCCG CGTTTAAAAC 51 TGAGAAAGAG CCCATAACGC AAACACGAAA TGGTCAAAGT AGCGTTTGGC 101 GTTTCGGTGG AAGTGATAAG GCAGCGAAAG CATCCACCGT AACGCTTAGA 151 GGTGTCATCT ACATGCTCTT CGACAACTGC GGCAAAGACG TCAATAAGAC 201 CATTTTACCC CTCGGCCACG GTGACCCTTC CGTCTACCCT TGCTTCCGTA 251 CCTGTATCGA AGCTGAAGAC GCCGTCGTCG ACGTCCTTCG CTCCGGCAAA 301 GGCAATTCTT ACGGTCCCGG AGCTGGGATT CTCCCCGCAA GACGAGCCGT 351 TGCTGATTAT ATGAACCGAG ATCTTCCGCA CAAGTTAACG CCTGAAGATA 401 TTTTTCTGAC CGCTGGATGC AACCAAGGGA TAGAGATCGT GTTCGAATCG 451 TTGGCTCGAC CAAACGCAAA CATCTTGCTC CCACGTCCTG GCTTCCCTCA 501 CTACGACGCT CGTGCTGCTT ACAGTGGTCT CGAGGTTCGC AAGTTTGATC 551 TTCTTCCCGA GAAAGAATGG GAGATTGATC TTGAAGGTAT CGAAGCCATT 601 GCAGACGAGA ACACTGTGGC TATGGTTGTA ATTAACCCCA ACAATCCCTG 651 TGGAAATGTC TACTCTCACG ACCATCTCAA AAAGGTTGCA GAGACGGCTA 701 GGAAGCTCGG GATAATGGTG ATCTCAGACG AAGTATATGA CCGAACTATA 751 TTCGGAGACA ATCCATTTGT TTCAATGGGG AAGTTTGCTT CGATAGTCCC 801 TGTATTGACA CTAGCAGGCA TATCTAAGGG ATGGGTTGTT CCTGGATGGA 851 AAATTGGCTG GATCGCCTTG AATGATCCCG AGGGCGTTTT CGAGACCACC 901 AAGGTGTTAC AATCCATCAA ACAGAATCTT GACGTAACTC CTGACCCTGC 951 CACAATAATT CAGG