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咖啡种质资源DNA指纹图谱构建 　　摘 要 选用4份咖啡种质资源为材料，对S1-S100共100个RAPD引物进行筛选，选出多态性好的引物10个。利用这10个RAPD引物对28份咖啡资源进行扩增，共获得86条带，平均每个RAPD引物扩增出8.6条带，多态性谱带74条，多态性条带比率为86.0%。结果表明：供试咖啡种质资源遗传多样性较丰富；10个多态性好的RAPD引物中S8的鉴别效率最高，能将全部供试材料全部区分开，通过整合软件录入如所属种类、种质名称、采样地点、引物、RAPD-PCR 扩增数据以及电泳图片等相关信息，形成指纹图谱二维编码，构成咖啡种质资源的DNA指纹图谱，为咖啡种质资源品种权益保护及分子身份证构建奠定了基础。 　　关键词 咖啡 ；种质资源 ；RAPD ；指纹图谱 　　中图分类号 TS273 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.008 　　咖啡（Coffea spp.）为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）多年生常绿灌木或小乔木，原产非洲北部和中部的热带地区。咖啡属植物约有100多个种，通常所指的咖啡为小粒种、中粒种、大粒种和查理种。目前全世界驯化栽培的主要有小粒种（C. arabica L.）和中粒种（C. canephora Pierre），面积约占70%和30%[1-3]。小粒种咖啡为异源四倍体种，自花授粉，而其他种均为二倍体，异花授粉。实际生产中，咖啡生产者在来源或者遗传背景不甚明了的情况下进行杂交或嫁接，以及地域间的引种利用等造成咖啡品种品系良莠不齐，变异性大，产生了大量的同物异名和同名异物，导致种子、种苗市场混乱的局面，阻碍咖啡产业的健康发展。传统的咖啡品种真实性和纯度是通过形态学、化学物质含量分析或者进行杯品等方法鉴定的[4-6]，耗时长、成本高、较难做到准确鉴别咖啡品种基因型。因此，对咖啡的核心种质的构建、种质的分类及真伪鉴定、品种权益保护等方面的研究显得十分必要。 　　DNA指纹图谱（DNA fingerprint）是鉴别不同品种、品系和不同无性系、不同基因型，以及辨别亲本与杂交后代遗传相关等方面的有力工具[7-9]，RAPD标记是以PCR为基础，采用随机引物对未知序列的DNA进行检测，根据扩增的多态性来反映基因组DNA相应区域的遗传关系，具有实验操作流程简单、所需仪器设备少、快速简便，通用性好，且无须事先知道目的DNA片断序列信息等许多优点，在生物的遗传多样性检测、品系鉴定、遗传图谱构建和系统学等领域得到广泛运用[10-12]。 　　近年来，咖啡的分子标记研究也取得了一些进展。王晓阳等[13]从514对SSR引物中筛选出1对特异性引物进行中小粒种咖啡的鉴定。该引物在小粒种中可扩增出双带，在中粒种中扩增出单带，从扩增产物的条带数目即可进行中小粒咖啡的鉴别。黄丽芳等[14]用筛选获得的18条RAPD多态性引物对72份咖啡种质资源进行RAPD扩增，结果表明，咖啡资源在种的分类水平上存在遗传关系多样性，部分资源的分类学地位与地理来源无相关性。本文利用RAPD标记技术，对28份咖啡资源进行遗传多样性分析，并筛选出稳定的，多态性好的RAPD引物，构建DNA指纹图谱，为咖啡资源的分子身份证构建奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试材料 　　供试材料为28份咖啡种质资源，其中大粒及查理种咖啡5份（编号1～5），小粒种咖啡10份（编号6～15），中粒种咖啡13份（编号16～28）。材料采自于海南，云南省德宏热带农业科学研究所（简称德宏所），云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（简称热经所），中国热带农业科学院香料饮料研究所（简称香饮所）。详见表1。 　　1.2 基因组DNA的提取 　　采用CTAB改良法进行咖啡叶片基因组DNA的提取[15]。提取的DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测质量，稀释至20 ng/μL，置于-20℃保存备用。 　　1.3 引物筛选及RAPD扩增 　　利用4份差异较大的咖啡模板，对RAPD引物S1-S100共100条随机引物进行多态性筛选，从中选取多态性好且扩增条带清晰的对实验样品进行扩增。引物由上海生工生物工程技术股份有限公司合成。 　　PCR反应体系为本课题组优化过的咖啡RAPD反应体系[16]：20 μL体系中，含ddH2O 13.75 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL，引物（10 μmol/L）1.2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，基因组DNA（20 ng/μL）1 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min；94℃变性1 min，38℃退火