基于UPLCQTOFMS植物代谢组学技术鉴别林下山参生长年限.docVIP

基于UPLCQTOFMS植物代谢组学技术鉴别林下山参生长年限 　　[摘要] 生长年限是影响林下山参质量的重要因素之一。为了对不同生长年限的林下山参进行鉴别，该研究采用基于UPLCQTOF/MS的植物代谢组学技术，并结合PCA和OPLSDA等多变量统计分析方法对11～15年林下山参芦头的代谢物进行研究。结果表明，不同生长年限林下山参芦头之间的代谢物组成有差异。为了提高鉴别效果，通过变量权重重要性排序（VIP）值筛选出对分类贡献大的差异代谢物，并以筛选的差异代谢物建立11～15年林下山参的OPLSDA判别模型，模型的解释率和预测率均较高，可用于鉴别市场上常见的11～15年林下山参。该研究建立了一种快速、准确、可靠的林下山参年限鉴别方法，同时也为其他中药材的年限鉴别提供了一种新的思路。 　　[关键词] 林下山参； 超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱； 植物代谢组学； 年限鉴别； 主成分分析； 正交偏最小二乘判别分析； 多变量统计分析 　　人参Panax ginseng C. A. Mey.为五加科人参属多年生宿根草本植物，是驰名中外的名贵中药材，具有广泛的药理活性和极高的药用价值[1]。人参中含有人参皂苷、多糖、蛋白、挥发油、无机元素等多种活性成分，这些活性成分随着时间的变化逐渐积累并呈现出一定的规律性[25]，所以人参的质量与其生长年限有着紧密的联系。而林下山参一般在生长10年以后才采收，是人为地把种子撒播到山林野生状态下任其自然生长的半野生山参，因为生长环境和野山参相似，其药用价值可以与野山参相媲美[6]。当前市场上林下山参的单支价格约为普通园参的十几倍，且生长年限越长市场价格越高[7]。悬殊的市场价格导致不法商人采取拼接等方法在生长年限上作假，致使市场上林下山参的质量良莠不齐，不利于林下山参产业的可持续发展。 　　目前林下山参年限的鉴别主要是通过传统的器官层次的性状鉴别，而这些性状特征易受外界环境因素的影响，且要求有丰富的鉴别经验，主观性较强，鉴别误差较大[8]。现代分析方法如HPLC[2，910]，UPLC[34]等也尝试应用于林下山参的年限鉴别研究，但是仅选用少数几个人参皂苷作为指标成分，缺乏全面性，难以确定不同生长年限之间的差异性成分。 　　植物代谢组学技术是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，对植物的某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的高通量分析技术[11]。目前基于GCMS[1213]，LCMS[1415]，NMR[1617]的植物代谢组学技术已应用于人参的年限鉴别研究，但是这些研究的研究范畴仅限于生长年限在6年以下的园参，且研究部位都是主根。当前参龄在10年以上的林下山参是市场上高品质商品人参的主要来源，而对其年限鉴别的研究还未见报道。此前老药工主要通过芦头形状和芦碗数来判断人参的生长年限，暗示芦头可能含有具有指示人参年限的特征代谢物。超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOF/MS）集合了UPLC快速高效的色谱分离能力和QTOF的高分辨率、高灵敏度的优点，是植物代谢组学研究领域中普遍采用的样品分析技术之一[18]。因此，本实验采用基于UPLCQTOF/MS的植物代谢组学技术对11～15年林下山参芦头的代谢物进行研究，并结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）等多变量统计分析方法，筛选出区分不同生长年限林下山参的差异代谢物，期望从新的角度为林下山参的年限鉴别提供参考，同时从化学角度探讨传统老药工通过芦头判断人参年限的科学性。 　　1 材料 　　Acquity UPLCSynapt G2 QTOF联用仪，配有MassLynx V4.1质谱工作站（美国Waters公司）；xS105型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Biofuge primo R台式离心机（美国Thermo公司）。 　　甲醇、乙腈（质谱纯， 德国Omni公司）；甲酸（质谱纯， 美国Sigma公司）；实验用水为自制超纯水（MilliQ系统，美国Millipore公司）；11～15年生林下山参于2015年9月采自辽宁省桓仁县林下山参基地，12年和13年林下山参各8个样本，其他3个年份各6个样本。林下山参的生长年限通过基地的种植记录确定，且所有样本均经南京农业大学郭巧生教授鉴定为五加科植物人参P. ginseng。 　　2 方法 　　2.1 供试品溶液的制备 　　将林下山参样品分为叶、芦头、主根、侧根4部分，取不同生长年限的芦头作为供试品，粉碎后过80目筛。分别取各供试品粉末10 mg，精密称定，置于1.5 mL离心管中，加入70%甲醇水溶液500 μL，称重，室