基于ITS2条形码中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定.docVIP

基于ITS2条形码中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定 　　[摘要]该研究收集天南星及其混伪品7种，共58份样品，通过DNA提取和PCR扩增，经注释后获得其ITS2条形码，然后进行序列变异分析和NJ树聚类分析。结果表明天南星3种基原天南星、异叶天南星和东北天南星的种内K2P距离均小于其种间K2P距离，在NJ聚类树上天南星3种基原分别聚为独立的支。天南星3种基原与天南星混伪品聚为不同的支。因此，ITS2作为DNA条形码可以鉴定天南星3种基原及其混伪品，DNA条形码技术可为天南星及其混伪品的鉴定提供新的方法。 　　[关键词]天南星；ITS2；DNA条形码；鉴定 　　天南星为我国常用中药，其性味苦、辛、温、有毒，具有消肿散结之功效，外用可治疗痈肿，蛇虫咬伤。据2010年版《中国药典》记载，天南星为天南星科植物天南星Arisaema erubescens （Wall.） Schott、异叶天南星A. heterophyllum Bl.和东北天南星A. amurense Maxim的干燥块茎[1]。由于历代本草记载的不一致和各地民间的用药习惯，中药材天南星基原比较混乱[2]。除天南星属植物外，天南星科半夏属植物虎掌Pinellia pedatisecta Schott也常作为天南星的代用品而被广泛使用[3]。天南星为有毒类中药，严重可窒息，甚至昏迷和呼吸停止[4]。天南星基原及其混伪品多为有毒植物，形态鉴定困难，已有的鉴定方法如性状鉴定、显微鉴定、HPCE鉴定[5]、近红外光谱鉴定[6]、PAGE[7]鉴定均具有不同程度的局限性，急需建立简捷、准确的鉴别方法用于天南星及其混伪品间的鉴定，以保障临床用药安全。 　　DNA条形码在中药材鉴定中的成功应用带来生药鉴定方法革命性的突破[8]。当前，国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，该指导原则规定植物类药材的DNA条形码鉴定以ITS2序列为主[9]。目前，基于ITS2序列的植物类药材DNA条形码鉴定研究开展的较多，如：孙稚颖等基于ITS2条形码对中药材赤芍及其易混伪品进行DNA分子鉴定研究[10]，罗?j等开展的多基原药材秦艽ITS2条形码鉴定研究[11]，谷巍等开展的芡实及其近缘种药材ITS2条形码鉴定研究[12]，樊丛照等开展的维吾尔药材香青兰DNA条形码鉴定方法的研究[13]，DNA条形码在中药材鉴定中的成功应用对中药鉴定的标准化和中药现代化发展具有重要意义。 　　本研究基于ITS2序列尝试对7种，58份天南星及其混伪品样品进行DNA条形码鉴定，探讨建立简捷、准确的中药材天南星及其混伪品鉴定方法。 　　1 材料 　　本研究共收集7种，58份样本。其中实验样本48份（表1），包含东北天南星、齿叶东北南星、天南星、异叶天南星、花南星、虎掌，实验材料由中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员进行鉴定。其余10条ITS2序列来自于GenBank，包含天南星6条（登录号JF975892-7），黄苞南星2条（登录号JF975899-900），细齿南星2条（登录号AB605025，EF017383）。 　　2 方法 　　2.1 DNA提取、PCR扩增和序列测定 块茎经75%乙醇擦拭表面后，称取35 mg，在MM400球磨仪（德国Retsch）上进行研磨，然后利用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取流程参照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则进行适当调整[9]，变色硅胶干燥叶片称取20 mg，在MM400球磨仪（德国Retsch）上进行研磨，使用天根植物基因组DNA提取试剂盒按操作步骤提取即可，PCR扩增使用植物DNA条形码ITS2序列通用引物、反应体系和扩增条件[14]。PCR 扩增产物经纯化后，使用ABI 3730XL 测序仪进行双向序列测定。 　　2.2 数据处理 利用CodonCode Aligner 4.2.4 （CodonCode Co. USA）对测序峰图进行校对、拼接和引物区去除，并使用真菌数据库检查可能的真菌污染[15]。基于隐马尔可夫模型（HMM）进行ITS2序列注释[16]。使用Muscle 3.8 进行多序列比对[17]，使用Paup 4.0进行K2P遗传距离计算[18]，使用MEGA 6.0构建NJ（邻接法）系统聚类树[19]，利用bootstrap （1 000次重复） 检验各分支的支持率。 　　3 结果与讨论 　　3.1 天南星药材DNA提取与PCR扩增 天南星块茎样品采用植物基因组DNA提取试剂盒并做适当调整，56 ℃水浴过夜，基因组DNA经电泳检测后条带均成弥散状态，说明基因组DNA存在不同程度的降解。所有天南星样品（叶和块茎）均可使用ITS2通用引物进行PCR扩增，电泳条带清晰，扩增片段