基于异类相制雷公藤复方配伍减毒代谢组学研究お.docVIP

基于异类相制雷公藤复方配伍减毒代谢组学研究お 　　[摘要]采用基于气相色谱质谱联用技术（GCMS/MS）的代谢组学方法，分析雷公藤复方配伍前后对大鼠血浆中内源性代谢物的变化，以期阐明基于“异类相制”中医理论的清络通痹方对雷公藤的配伍减毒机制。通过GCMS/MS分析获得空白对照组、雷公藤组和清络通痹方组大鼠血浆代谢轮廓，正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）显示3组在得分图上区分明显， 清络通痹方组各观测值存在着向正常组移动的趋势，提示了清络通痹方的配伍减毒功效。通过变量重要性投影（VIP）值和单因素方差分析筛选差异性代谢物，发现雷公藤组中生糖氨基酸包括丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸等水平显著升高，支链氨基酸缬氨酸和异亮氨基酸水平下降，清络通痹方则能够逆转氨基酸水平的紊乱。进一步的代谢通路分析提示清络通痹方配伍减毒机制可能与谷氨酸和谷氨酰胺代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢相关。该研究从代谢的角度，说明了雷公藤肝脏毒性的发生与氨基酸代谢，能量代谢等过程密切相关，而清络通痹方通过改善机体氨基酸水平发挥配伍减毒作用。 　　[关键词]异类相制；雷公藤；代谢组学；肝毒性；清络通痹方 　　雷公藤作为中国传统医学中的一种常用中药，具有活血化瘀、清热解毒、消肿散结的功效，临床上广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎等疾病。尽管雷公藤治疗免疫系统疾病疗效确切，却存在明显的肝毒性[12]。雷公藤的临床治疗窗较窄，对机体毒性损伤严重，是目前亟需解决的问题。在国医大师周仲瑛的指导下，南京中医药大学周学平教授以临床实践为基础，提出 “异类相制”的学术指导，即通过具有不同功效的中药配伍来制约雷公藤毒烈偏颇之性的效用[34]。在此基础上，周学平教授用青风藤15 g，生地15 g，三七10 g，僵蚕3 g与雷公藤5～15 g相配伍，组成“清络通痹方”。该方在临床上能够明显的降低雷公藤产生的肝毒性。该方中，三七散瘀止血、消肿定痛，生地清热生津、滋阴养血，与雷公藤配伍能达到异效相制、扶正制毒的功效。周聪等通过加减配伍药对的方法证实，在清络通痹方中，生地和三七对正方配伍减毒的功效贡献度最大[5]。尽管清络通痹方配伍减毒的疗效确切，然而目前都是从单一的信号分子通路去研究，缺乏整体的评价体系和研究方法。 　　代谢组学的发展给中医药毒性评价和毒性机制研究带来新的机遇和挑战[67]。运用代谢组学技术能够从整体角度评价生物体产生的毒性变化，预测毒性产生，寻找毒性相关生物标志物，从而阐明毒性机制。Xiong等建立了GCMS的代谢组学方法全面表征对乙酰氨基酚诱导的肝毒性[8]；Gonzalez等建立的基于液相的代谢组学方法评价急性肝损伤可能发生的机制[9]。因此，本文在前期实验的基础上，运用代谢组学技术手段来阐述清络通痹方配伍减毒的可能机制，为“异类相制”中医理论的科学内涵提供技术支撑，为其他毒性中药以及毒性中药配伍理论的探讨提供新的研究思路。 　　1材料 　　低温高速离心机（Beckman，美国）；真空旋转挥干仪（Speedvac，Thermo Savant，美国）；气相色谱三重四级杆质谱联用仪（GCMS/MS，Thermo，美国）；气相毛细管柱为熔融的硅烷化石英毛细管（DB5固定相，018 mm×10 m，018 μm，Thermo，美国）。 　　1，213C2肉蔻酸（同位素内标）、盐酸甲氧胺、吡啶、三甲基氯硅烷（TMCS）、N甲基N三甲基硅烷三氟乙酰胺（MSTFA）均购自SigmaAldrich，MSTFA含1%TMCS；甲醇和正庚烷（色谱纯）均购自Merck公司（德国）；超纯水（自制，Millipore，美国）；各鉴定用对照品、乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）等其他试剂均为分析纯。 　　雷公藤药材产自四川西昌，批号120620；三七、地黄、僵蚕、青风藤药材均购自安徽亳州中药饮片厂，批号111208。经南京中医药大学药学院中药鉴定教研室刘圣金博士鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部中相关规定。 　　雌性SD大鼠30只，体重（200±20） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京 　　2方法 　　21动物实验实验开始前，30只雌性SD大鼠在屏障环境中适应7 d，自由摄取食和水。实验开始时，将大鼠随机分成3组，空白对照组、雷公藤组和清络通痹方组，每组10只。每天早晨灌胃给药10 mL?kg-1，连续28 d。实验结束，取大鼠血浆于离心管中，置于-20 ℃冰箱保存备用。 　　22药材提取临床上雷公藤常用剂量为008～025 g?kg-1?d-1，前期试验发现，10倍临床剂量的雷公藤能够诱导产生稳定、明显的肝毒性（即08～25 g?kg-1?d-1），推算至