基于形态学特征和ITS序列分析秦巴山区天麻萌发菌亲缘关系.docVIP

基于形态学特征和ITS序列分析秦巴山区天麻萌发菌亲缘关系 　　摘要：利用拮抗试验，萌发试验和ITS序列分析技术对秦巴山区12个天麻萌发菌菌株进行了亲缘关系分析。结果表明：12个萌发菌菌株分为两大类，其中8103-4、8103-6、8103-7、8103-8这4个菌株与其他菌株拮抗反应明显，并且ITS序列分析显示在同一个分支上，亲缘关系相近；萌-3、萌-7、萌MD-2、萌发菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南此8个菌株拮抗反应不明显，ITS序列分析显示在同一个分支上，8103-3、萌发菌与标准菌种Mycena citrinomarginata亲缘关系相近，萌MD-2、石斛小菇-1、萌-3、萌-7、石斛小菇-2、萌-云南与Mycena purpureofusca亲缘关系相近。 　　关键词：天麻萌发菌；拮抗；rDNA序列；亲缘关系 　　中图分类号：S182文献标志码：A文章编号：1002-1302（2016）05-0245-04 　　萌发菌隶属于担子菌纲（Basidiomyeetes）伞菌目（Agarieales）口蘑科（Trieholomataeeae）小菇属（Myeena）[1]，主要包括紫萁小菇（M . mosmundicola）、石斛小菇（M . mdendrobii）和开唇小菇（M . manoectochila）三大类属。天麻萌发菌主要分布于我国陕西、云南、甘肃、河南、河北、湖南、湖北、贵州、新疆、四川、安徽、黑龙江、吉林、广西、海南、福建、内蒙古、西藏及台湾等省区[2]，为天麻（Gastrodia elata）有性繁殖时的必要共生菌。天麻种子细小如粉尘，无胚乳及其营养贮备，无外源营养供给，种子不能发芽。它的萌发靠小菇属（Mycena）一类真菌菌丝侵染种胚提供营养，促使其萌发[3]。随着天麻药用需求不断增加，野生资源日益匮乏，且人工栽培中以无性繁殖来连续种植，天麻球茎明显退化，侧芽发芽率低等原因，经过有性繁殖培育0代天麻或1代天麻，再通过无性繁殖扩大种植已成为天麻稳产和高产的重要途径[4-5]。目前，国内外对天麻萌发菌种质资源研究报道较少，且主要集中于地区优良栽培品种的筛选和生物学特性的研究，如冉孝琴等对贵州天麻萌发菌优良菌株进行了筛选[6]；李方安等对紫萁小菇生物学特性进行了初步研究[7]。 　　由于天麻萌发菌菌株市场上命名混杂，且物种间形态差异不大，通过形态鉴定较为困难。目前，秦巴山区天麻萌发菌菌种的亲缘关系尚无相关研究报道，萌发菌菌种的种源关系不明确，缺少适宜地域栽培生长的天麻萌发菌菌种，对于培育出适合秦巴山区栽培的优良高产菌种的难度较大。利用rDNA ITS序列分析技术[8]，可以直接提取蕴含于基因组内的遗传信息，检测和比较传统形态学无法区分的相似菌株种间或种内差别，具有快速、灵敏、准确的优点。笔者选取秦巴山区8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌发菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南共12个天麻萌发菌主要栽培菌株，对其形态特征及核糖体转录间隔区（ITS）进行序列分析，并进一步对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对，构建系统发育树，以期为基于传统形态特征对秦巴山区天麻萌发菌菌株之间的亲缘关系提供分子依据，为天麻萌发菌建立种质资源库及优良菌种的选育提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1供试菌株8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌发菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南共12株萌发菌菌株：由陕西省资源生物重点实验室食药用菌菌种保藏中心提供。 　　1.1.2改良CPDA培养基包括马铃薯200.0 g，玉米粉 50.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4?7H2O 3.0 g，NH4NO3 5.0 g，维生素B1 10 mg，琼脂 15.0 g，加水至1 000 mL，pH值自然。CPDA液体培养基，根据上述改良CPDA培养基配制，但不加添琼脂。 　　1.2方法 　　1.2.1拮抗试验制备试管斜面培养基，活化各菌株，每株3管；取试管活化菌株在同一培养皿上对称接种2个菌株，24 ℃ 恒温培养7 d，观察菌丝间的拮抗反应情况。 　　1.2.2萌发试验青冈木树叶浸泡24 h后，平铺在培养皿表面，接种各萌发菌菌株，每株3个，24 ℃ 恒温培养7 d，选取未开裂、颜色较深、富有弹性且大小相近的天麻果实，均匀播撒在培养皿中，24 ℃ 恒温培养60 d，期间定期定量加水，观察萌发情况。 　　1.2.3液体发酵制备CPDA液体培养基，分装于250 mL三角瓶中，每瓶装液量150 mL，于1.034×105 Pa灭菌 30 min，冷