毕业论文林伟斌课题结果汇总.doc

第一部分：荧光定量PCR实验 一、实验材料 1．主要试剂： Bacto-trypton、Bacto-yeast extracion 英国OXOID公司产品 氨苄青霉素： 德国B.M.公司产品DH5α感受态菌株： 为本实验室提供 T-载体质粒Pmd18 大连宝生物工程公司产品100bp ladder，λ-DNA EcoRⅠ/HindⅢ marker 华美生物工程公司产品 QIAE Ⅱ Agarose Gel Extraction Protocal 德国Qiagen公司产品 RESINcolumnTM小批量质粒DNA纯化系统 华美生物工程公司产品 细胞RNA提取试剂: Trizol 索奥公司产品 RT-PCR试剂 索奥公司产品 逆转录酶系： 索奥公司产品 dNTPs: 索奥公司产品 DEPC 美国Sigma公司产品RNasin 美国Promega公司产品 2.主要实验仪器： 超净工作台： 苏州净化设备公司紫外分光光度计（UV-1206）： 日本SHIMODZU公司产品冷冻离心机（SCR20B）： 日本HITACHI公司产品台式低温高速离心机（Z323K） 德国HERMLE公司产品台式高速离心机（TGL-16G） 上海安亭科学仪器厂产品水平离心机 上海安亭科学仪器厂产品 水平式电泳仪 北京东方仪器厂产品GDS7600凝胶扫描系统（DF-23B） 英国UVP公司产品HZ－25空气恒温振荡器 江苏大仓医疗仪器厂产品普通培养箱 日本SANYO公司产品电子天平（BS210S） 日本Satorius 公司产品－80℃冰箱 日本SANYO公司产品PE97 PE7700荧光定量PCR扩增仪 美国PE公司产品 二、实验方法 荧光定量RT-PCR检测HSP27方法的建立 荧光定量PCR是近两年发展起来的一项新技术[43-45]。其原理是在常规PCR扩增系统中加入一段与靶基因特异互补的荧光标记探针。探针的5端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等。3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。探针的3端羟基已被封闭，不具有延伸功能。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号。随着PCR扩增的进行，引物沿着模板延伸， Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5→3外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。用荧光检测仪检测荧光值的变化，即可准确判定扩增产物的量。荧光定量PCR方法就是利用此原理，在PCR过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值，此时的循环次数（用循环阈值