第六章、基于全基因组序列的高通量基因克隆.pptVIP

第六章、基于全基因组序列的高通量基因克隆 第一节、? 概述 拟南芥菜和水稻的基因组测序已经完成，玉米、小麦等主要农作物的基因组测序工作也已启动。在许多作物中已获得了大量的表达序列标签（EST）信息。利用这些丰富的序列信息可以大大加快功能基因的鉴定、遗传机理的探索等。 第二节、高通量克隆植物功能基因－基因标签法 6.2.3. 激活标签（activation tagging） 传统的T-DNA或转座子插入使基因失活，这些方法在研究冗余基因的功能时就不敷应用，也无法分离那些功能失活后会造成早期致死、雌雄配子败育的基因。在拟南芥菜中，少于10％的基因标签会产生可见的性状变异，因此必须用其他的方法来分离功能基因。 第三节、?? 基因陷阱（Gene Trap） 报告基因（reporter gene）的插入产生融合基因，融合基因可用来检测单个基因的表达。通过这样方法，根据基因在不同时间和不同条件下的表达谱来分离基因。因为插入DNA的序列已经知道，这一序列可用作“标签”很容易分离到基因。 第三节、??????? TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes） 这是一种高效的用反求遗传学的方法来研究功能基因，它可以大范围筛选通过化学方法诱导的突变体，适用于拟南芥菜和其他各种植物。 报告基因用来构建三种基本的基因陷阱载体：增强子陷阱、启动子陷阱和基因陷阱。每一种类型能应答插入位点的顺式作用调控序列。 在增强子陷阱中，报告基因与启动子的TATA框和转录起始位点相融合，此时的少量启动子序列不会引起报告基因的表达，但是，当附近有增强子元件时启动子被激活使报告基因表达。 启动子陷阱和基因陷阱含有无启动子的报告基因，因此只有当插入到转录单位且方向相同时，报告基因的表达才有可能发生。 启动子陷阱中，报告基因插入到exon时才表达，相反，基因陷阱中的报告基因带有剪接序列，当插入到intron中时才表达。 基因陷阱提供了很有效的方法来鉴定基因，因为这一系统是建立在报告基因表达基础上的，不需要突变的性状，因此在分离传统方法上很难分离的二类基因上很有用：1）功能冗余的基因；2）在不同发育阶段上起功能的基因（各个发育阶段上的基因发生突变的话很可能导致致死突变）。 最近，Jeong等人又开发出了新的T-DNA载体，pGA2715，这一载体具有启动子陷阱和激活标签二种特性。这一载体在右边界含有一个无启动子的GUS报告基因。另外，有多个35S增强子位于左边界。 用这一载体总共产生了13，450个T-DNA插入系。GUS的组织化学检测表明GUS着色频率比不带增强子的载体高二倍。增强子插入位点附近的基因表达明显增加。因此用pGA2715转化的系既可用gus报告基因筛选启动子，又能产生功能获得（gain-of-function）突变。 * 各种生物的基因组序列完成以后，一般都可以从Internet网上获得，同时发展了许多新的技术来利用、开发这些序列信息，这从更本上改变了人们探究生物学的方法和途径。反过来，这些新的技术与方法的应用又加快了人们对一些主要作物的改造。将来生物领域会怎样发展很难预计。 植物基因组的大小差别很大，基因组大小的这种差异主要是由重复序列造成。被子植物中所必须的基因数目不会差异很大。 这可从禾谷类作物的基因组分析中看出来，禾谷类不同作物的基因组差异很大，如水稻的基因组只有玉米的20％、小麦的3％，而基因组成和顺序存在着广泛的同线性。从水稻中获得的基因序列信息可以用来从其他禾谷类作物中分离相对应的基因。 目前从各种作物中已获得大量的EST序列，这些序列在模式植物和研究植物之间作为一种基因同形体（isomorphisms），提供一种跨基因组差异的平台，来利用模式作物广泛的序列信息。如，在与某一功能相关的基因被克隆到以后，就可以用它在其他作物中找到同根基因（orthologs）。 各种显花植物大量EST的产生以及水稻、拟南芥菜等基因组序列的完成，就有可能来研究高等植物基因组序列的相似性。 大多数的基因在不同的高等生物中表现出核苷酸序列和氨基酸序列的相似性。很少有编码蛋白的被子植物基因在拟南芥菜和水稻中没有同根基因（orthologs）。 高等植物发育上的差异可能主要是由于转录调控因子反式调控序列的变化。 在某些情况下，基因结构和表达上的细微变化会导致在性状上的巨大变化。 如高等植物中总共可产生200种脂肪酸，这些脂肪酸的变化主要在双键（double bond）、羟（基）氢氧基（hydroxyls）环氧基团 (epoxy groups)、三键 (triple bond)