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基于毛细管液滴技术血液乙型肝炎病毒DNA提取 　　摘 要 基于毛细管液滴技术，建立了提取血液中乙型肝炎病毒（HBV）DNA的方法。方法的基本原理是向聚四氟乙烯毛细管中连续引入油相和水相溶液时，由于表面张力作用， 可以形成稳定的油包水型液滴。依次引入含有不同试样的液滴，在毛细管中完成进样、DNA结合、洗涤以及洗脱等过程。实验表明，采用蛋白酶K裂解和提高洗脱温度有利于提高DNA回收率。优化后的血清HBV DNA提取操作在25 min内完成，回收率大于60%。本方法的DNA提取量与常规方法相当，而相对标准偏差较大（23.3% vs 12.9%）。本方法具有简单、快速和低成本的优势，有望成为一种微全核酸分析系统样品前处理的有效解决方案。 　　关键词 微全核酸分析系统; DNA提取; 液滴; 毛细管; 乙型肝炎病毒?? 　　 　　 　　1 引 言?? 　　微全分析系统是将分析实验室的全部功能集成于一个微型化装置，应用于包括分子诊断、细胞分析等领域。用于核酸分析的微全系统主要包括DNA纯化、扩增与检测等功能单元。已报道的多种基于微流控芯片平台的微全核酸分析系统，显示出了微型化、集成化、低消耗以及分析快速的优势。芯片微全核酸分析系统也面临一些问题，如加工和使用成本高、控制复杂等。针对这一问题，许多研究者致力于开发低成本微型化核酸分析装置。以标准毛细管为反应器的振荡流PCR装置，为实现低成本微全核酸分析带来了希望。上述装置使用压力差或微量注射泵驱动PCR液滴在不同温度区间往复运动，实现热循环反应。这种设计减少了温度变化延迟，因而可以显著缩短反应时间。由于使用标准毛细管作为反应器，振荡流PCR装置具有明显的成本优势。这种核酸分析方法面临的问题是未能集成核酸提取与纯化，因而尚不能实现集成化核酸分析。针对该问题，本研究基于毛细管液滴技术，建立了DNA提取方法，并用于提取血液中乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）DNA。本方法利用聚四氟乙烯（PTFE）的疏水特性，在毛细管中形成油包水液滴。通过向毛细管中依次引入含有不同试样的液滴完成DNA提取及纯化。本方法有望与振荡流PCR结合，发展成为低成本微全核酸分析系统。 　　2 实验部分?? 　　2.1 实验装置 ?? 　　自行搭建的分析装置(图1a)有两个温度控制模块，每个模块从上至下分别为聚碳酸酯盖板、带有毛细管嵌合沟槽的加热铝板、Peltier加热片（北京帕尔贴公司）以及固定铝板。加热铝板表面有8个平行沟槽，嵌有聚四氟乙烯毛细管（内径1.0 mm，外径1.4 mm，江苏宏泰公司）。毛细管末端与多通道微量注射泵（保定兰格公司）连接，通过设定注射泵运行程序控制管中液滴的运动。在温控模块上方的聚碳酸酯盖板上有沟槽，用于插入磁铁。加热铝板镶嵌有PT 100温度传感器（东阳三星公司），与温控器 (日本Yamatake公司)连接，用于探测温度。计算机控制软件根据温度感应反馈信号至温控器，控制下位继电器是否输送电流至Peltier加热片。控制软件界面显示已经运行和尚未进行的注射泵运行程序，以及各个温度模块的设定与实际温度。?? 　　图1 (a)毛细管核酸提取装置结构示意图，(b)DNA提取过程示意图?? 　　Fig．1 (a) Schematic representation of experimental instrument, (b) Illustration of process of droplet-based DNA extraction in a capillary?? 　　1. 加热模块（Heating modules）; 2. PT 100温度传感器（Sensor); 3. 磁铁(Magnet)；4. 微量注射泵(Syringe pump);?? 　　5. 继电器(Relay); 6. 电源(Electric power source); 7. 温控器(Distributed multi-channel controller); 8. 计算机(Computer)。 　　2.2 DNA提取与纯化?? 　　毛细管中DNA提取使用磁珠提取试剂盒（杭州博日公司）。HBV阳性与阴性样品（小牛血清，美国Invitrogen公司）经荧光定量PCR分析确认。含HBV血液加入血清管，静置后获得血清。使用加热裂解提取法时，微量注射泵控制毛细管顺序吸取5 　　??@ L矿物油，25 　　??@ L 裂解液，2 　　??@ L磁珠液和5 　　??@ L血清。微量注射泵拖动上述溶液在90℃温区停留1 min后运行至30℃温区，并在该温区往复运动,完成磁珠与DNA结合。之后，液滴运行至磁铁区,将磁珠定位于该区。排出废液后引入10 　　??@ L洗涤液，洗涤磁珠两次