多肽植物激素系统素及相似多肽质谱裂解机理和反相色谱保留规律研究.docVIP

多肽植物激素系统素及相似多肽质谱裂解机理和反相色谱保留规律研究 　　DOI： 10.3724/SP.J.1096.2011.01147 　　 　　1（北京大学化学与分子工程学院，北京 100871）2（桂林理工大学化学与生物工程学院，桂林 541004） 　　摘 要 采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）联用技术，研究了系统素及其相似多肽的质谱裂解机理和色谱保留规律，探讨了它们的碰撞诱导解离规律。结果表明，系统素准分子离子一般带有2～5个电荷；在低碰撞能条件下，多肽母离子发生碰撞诱导解离，产生b型和y型碎片离子；烟草系统素 I最强母离子［M＋3H］3＋的最优碰撞能为22 V；番茄系统素、土豆系统素Ⅰ、土豆系统素Ⅱ、辣椒系统素和龙葵系统素的最强母离子均为［M＋4H］4＋，最优碰撞能均为18 V；在最优碰撞能作用下，系统素的碎片离子信息丰富，特征碎片离子峰的强度最大，适合对系统素的分析；样品中三氟乙酸的含量对系统素及相似多肽在反相色谱柱上的保留影响明显。 　　关键词 系统素； 植物多肽激素； 液相色谱-四级杆飞行时间质谱； 裂解机理； 保留规律 　　 　　 2010-11-17收稿；2011-03-17接受 　　本文系国家自然科学基金（Nos.和中国博士后科学基金（No. 201003008）资助项目 　　* E-mail：hwliu@pku.edu.cn 　　 　　1 引 言 　　植物多肽激素与其它小分子激素一样，参与了植物的生长、发育等过程的调控，是一类非常重要的植物激素［1～5］。已发现的植物多肽激素主要有系统素、植物硫肽素和快速碱化因子等，其中番茄系统素是研究最早、最多的一类多肽激素［6］。系统素作为系统性防御反应的信号分子，在土豆、辣椒、龙葵等其它茄科植物中也存在，它们具有相似的功能［4, 7］，但各系统素的氨基酸组成及序列有明显的差异（表1）。另外，系统素在植物体内的含量甚微，快速、准确测定其含量仍面临很多挑战［6, 8, 9］。质谱在多肽定性与定量分析及结构鉴定方面有显著优势，利用多肽在不同质谱条件下的裂解规律及碎片信息，可发现和确认新的植物多肽激素［10］。此外，多肽在色谱柱上的保留具有一定的规律和可预测性，可采用LC对目标多肽进行定性与定量分析［11, 12］。本研究采用液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间质谱（LC-ESI/QTOF-MS）联用技术，系统研究了系统素及相似多肽的质谱裂解机理和色谱保留规律，为准确研究系统素及发现新的植物多肽激素提供了新的分析方法。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　AcquityTM 超高效液相色谱仪、Xevo QTOF MS质谱仪和MassLynx V4.1数据处理系统（美国Waters公司）。 　　番茄系统素、土豆系统素Ⅰ、土豆系统素Ⅱ、辣椒系统素、龙葵系统素、烟草系统素Ⅰ、系统素-14、系统素-22和系统素-Ala（4），共9种多肽，均由北京中科亚光生物科技有限公司合成，其英文名称、英文缩写、氨基酸组成及序列见表1；甲醇、乙腈和甲酸（美国Dikma公司）；三氟乙酸（美国Acros公司），其它试剂均为分析纯。 系统素标准储备液（1.0 g/L）采用10%（V/V）乙腈酸性水溶液（含0.1%甲酸）配制；工作溶液用含0.1%甲酸和0.1%三氟乙酸的10%乙腈酸性水溶液稀释。所有样品均保存在5 ℃冰箱中。 　　2.2 分析条件 　　2.2.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm, 美国Agilent公司）；流动相A： 含0.1%甲酸的90%乙腈溶液；流动相B：含0.1%甲酸的2%乙腈溶液；梯度洗脱：0～10 min, 5%～15% A；10～18 min 15% A。流速0.2 mL/min，柱温为室温，进样量10 μL。 　　表1 系统素和系统素类似物对应的氨基酸序列及母离子峰 　　Table 1 Systemins, systemin analogues, and corresponding amino acid sequences and parent ions 　　2.2.2 QTOF-MS主要参数 正离子扫描（ESI＋ ，m/z 100～1200），毛细管电压3.0 kV，样品锥孔电压28 V，取样锥孔电压4.0 V；离子源温度90 ℃，脱溶剂气温度250 ℃；样品载气流量40 L/h，脱溶剂气体流量600 L/h。在MS/MS实验时，除了需要设定碰撞电压外，其它实验参数的设置与MS实验一致。 　　3 结果与讨论 　　3.1 系统素及相似多肽的MS谱图分析 　　系统素及相似多肽的MS