多重RTPCR方法检测新型甲型H1N1流感病毒研究.docVIP

多重RTPCR方法检测新型甲型H1N1流感病毒研究 　　摘要:为了建立快速检测新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技术,根据GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列,设计并合成两套特异性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒和自行设计合成的引物建立多重RT-PCR反应,按照预期的PCR产物序列合成的DNA作为阳性对照。结果表明,该方法具有良好的特异性,可以将甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)与传统甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亚型流感病毒区分。该方法同时具有较高的灵敏度,最低可以检测到100个拷贝的阳性克隆质粒。在对183份发热病人临床咽拭子样品检测中发现了10份阳性样品,对350份猪鼻腔拭子样品检测全部呈阴性,结果与中国检验检疫科学研究院试剂盒检测结果一致,说明了该多重RT-PCR方法在临床检测新型甲型H1N1流感病毒方面具有广阔的应用前景。 　　关键词:多重RT-PCR;甲型流感病毒;H1N1亚型 　　中图分类号:S852.65文献标识码:B文章编号:1007-273X(2010)10-0008-03 　　 　　流行性感冒病毒简称流感病毒(Influenza virus),属正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。按其核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)和基质蛋白(matrix protein,M)的不同,可将流感病毒分成甲(A)、乙(B)、丙(C)3型。甲型和乙型流感病毒可以引起大的暴发流行和严重疾病;丙型流感病毒与普通感冒有关,主要在儿童中流行[1]。其中甲型流感病毒根据其表层血凝素蛋白和神经氨酸苷酶蛋白分类成不同亚型,至今为止发现16×9种不同组合的甲型流感病毒亚型。其中影响人类最重要的流感病毒是H3N2亚型和H1N1亚型,前者往往会与非常大规模的高死亡率有关[2]。 　　流感病毒普遍被认为是有能力重组其抗原基因结构和创造新的病毒株,比如改变其毒力、传染力或者宿主范围这些生物学特性[3]。基因重组在两个毒株之间发生是比较频繁的,但也有可能掺杂来源于不同物种的RNA片段。新型甲型H1N1即是一株在2009年全世界的人类范围中传播而暴发的变种流感H1N1病毒,7月份美国疾控中心(The U.S. Centers for Disease Control and Prevention,CDC)病毒学家在一名病患身上分离到一株甲型H1N1病毒,发现这株病毒由4种不同流感病毒株基因重组而成,包含有人流感病毒片段、来自北美和欧亚大陆的猪流感病毒片段和来自北美的禽流感病毒片段,这类病毒之前未曾报道有从人类或者猪的身上分离得到[4]。 　　流感病毒在变异重组过程中不断突破物种隔离和地理隔离的局限,在全世界范围内传播肆虐,给人类和家畜带来严重的威胁。由于病毒发生了变异,以往的病毒疫苗和诊断检验检疫技术已经不可以控制该病毒的传播,建立快速的检测方法从而进行早期诊断是有效防止疫情快速蔓延的方式之一。本研究根据GenBank中公布的甲型H1N1流感病毒2009年流行株的基因序列,设计了同时检测HA和NA基因的多重RT-PCR检测方法,期望为疫情的控制提供有力的技术支持。 　　 　　1材料 　　 　　传统的甲型H1N1和H3N2流感灭活病毒由广东温氏集团股份有限公司赠送。H5N1、H6N2和H9N2亚型流感灭活病毒购自哈尔滨兽医研究所。 　　新型甲型H1N1流感病毒阳性对照由上海旭冠生物技术有限公司合成,为甲型H1N1病毒2009年流行株HA和NA基因对应DNA序列。 　　 　　2方法 　　 　　2.1特异性引物的设计 　　在GenBank中搜索并获取2009年甲型H1N1流感病毒流行株的HA和NA的基因序列,利用分子生物学软件Clustal X进行多重序列比对,找到理想片段后用Primer Premier 5.0进行特异性引物设计,应用Oligo 6.0对引物评价分析。 　　为了满足检测新型甲型H1N1病毒的要求,引物的设计长度控制在15~30bp,引物扩增片段在300~ 　　1 000bp之间,其G+C含量35%~60%,Ta值介于50~60℃。无发夹结构、二聚体、错误引发情况及上下引物之间二聚体形成情况,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构。在/上利用BLAST功能对引物与其他基因进行同源序列分析。 　　2.2病毒核酸的提取 　　取200μL样品浸出液或灭活病毒用于病毒RNA提取,操作方法按照Invitrogen公司的TRIzol reagent试剂说明书进行。用20μL DEPC H2O溶解提取的RNA,-20℃保存备用。取2μL用于多重RT-PCR反应。 　　2.3多重RT