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复合微生态制剂制备及其脱氮效果分析 　　摘要：从沧州和天津地区共采集8个有效底泥样品，利用选择培养基从底泥中筛选出3株高效脱氮菌株，分别编号为31-A、33-A、41-A。3株菌株被分别鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereUS）。实验中探究了不同的温度、pH、转速对三株菌株的生长量的影响，最适的温度为37℃，最适的pH为8.0，最适的转速为120r/min。将三株菌株进行不同的配比培养，分别处理人工废水，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率高达87.22%、86.27%。 　　关键词：微生态制剂；氨氮；亚硝酸盐；枯草芽孢杆菌；蜡状芽孢杆菌 　　随着水产养殖业的高速发展，大部分养殖户采用了工厂化高密度、掠夺式的作业模式，这无疑给水体生态系统带来了强大的压力。近年来，养殖池塘水体恶化问题日趋严重，主要表现有池塘老化、水域污染、黑臭底泥淤积、有害物质积累等，由此导致水产动物病害频发。其中大量有毒的中间产物的富集――如氨氮、亚硝酸氮，是最主要的问题。亚硝酸盐氮能与生物体血红素结合成高铁血红素，造成组织缺氧；氨氮主要是对生物体产生强烈的神经性毒害，影响生理、生化各项指标与生长状况，严重时会造成大批生物死亡，其次高浓度的氨氮可以转化成亚硝酸盐氮。因此，如何改善养殖水体水质是一个亟待解决的问题。 　　微生态制剂（Probiotics）是与“抗生素”相对一个概念，又名活菌制剂（Bigone）或生菌剂，它一般是由人工培养菌群及其代谢产物和促进正常菌群生长的物质组成。因为绿色环保、无残留、无毒副作用等特有的优势已广泛地应用在水产养殖业，成为抗生素最有潜力的替代品，具有加速分解有机物质和降低生化需氧量以及氨氮、亚硝酸盐氮的含量的功能。本文通过从自然界中筛选有效脱氮菌株来制备复合微生态制剂，在最适的生长条件下来处理人工废水，定时判断复合制剂的脱氮效果。 　　1.主要仪器与方法 　　1.1主要仪器与材料 　　1.1.1主要仪器 　　蚌式采样器、高压灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、分光光度计、恒温振荡器、PCR仪、凝胶电泳仪 　　1.1.2材料混合培养基（营养肉汤培养基）：蛋白胨10g?L-1，牛肉膏5g?L-1，氯化钠5g?L-1，pH7.0。 　　硝化细菌培养基：葡萄糖5 g?L-1，硫酸铵0.5g?L-1，氯化钠0.3g?L-1，磷酸氢二钾1 g?L-1，硫酸镁0.3g?L-1，硫酸亚铁0.03 g?L-1，氯化钙0.03g?L-1。 　　反硝化细菌培养基：硝酸钾2g?L-1，硫酸镁0.2g?L-1，磷酸氢二钾0.5g?L-1，酒石酸钾钠20g?L-1。 　　人工废水：硫酸铵0.47g?L-1，亚硝酸钠0.2g?L-1，葡萄糖1g?L-1，柠檬酸钠0.1g?L-1，磷酸氢二钾0.0175g?L-1。 　　1.2方法 　　1.2.1采样方法 　　采集底泥时采用的蚌式采样器。为了避免采集的样品互相污染，在装置内衬一个塑料内套或者贴一层塑料膜，每采集一个样品更换一次。采集的样品分装到聚乙烯瓶子或盒子内，并及时做好标记。采集完样品后，要尽快将样品统一放人低温冰箱，并及时开展实验。底泥的存放最好不超过一个月。 　　1.2.2分离筛选方法 　　分别称取50g筛选样品于100mL的烧杯中，加入无菌水100mL，充分震荡。静置5min，取上清液分别稀释10、108、103、104、105倍。将稀释后的菌悬液分别涂布在硝化细菌分离培养基、反硝化细菌分离培养基上，并在37℃下培养48h。每个样品的每个稀释度都要做对照实验和重复实验。 　　观察培养后的菌落形态，挑取不同的菌株在营养肉汤固体培养基上划线，37℃培养48h或更长。选取没有分开的菌落进行二次甚至三次划线分离。将最后分离的单菌落转移到斜面培养基上，4℃保存。再次将分离得到的菌株接种到硝化细菌分离培养基、反硝化细菌分离培养基上进行验证。 　　1.2.3鉴定方法 　　对筛选到的菌株进行革兰氏染色显微观察，菌体平板生长形态和结构观察。 　　按照基因组DNA提取试剂盒的步骤，提取其基因组；用通用引物扩增得到其16SrDNA，经纯化后电泳并送上海生工生物公司测序；测序结果与NCBI数据库比对，构建其系统进化树，确定其所属种属。 　　PCR反应扩增16S rDNA，50μL反应体系配制为：基因组DNA 1μL，ExTaq 0.25/μL，10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，上下游通用引物各1μL，最后补充双蒸水至50/μL。反应条件为：反应前95℃预变性5 min，后95℃变性1 rain，55℃退火1min，72℃延