第10章 微生物与基因工程2幻灯片.pptVIP

10.3 微生物与克隆载体 载体的分类：根据DNA分子克隆的目的分：克隆载 体、穿梭载体、表达载体。 2、克隆载体的基本要求 （1）载体应是一个独立的复制子，具有复制的 起始序列，可在细胞中进行有效扩增。 3 克隆载体的种类 ⑥易于导入细胞。 质粒载体的优点： ②具有两种抗生素抗性基因可供转 化子的选择记号。 （2）λ噬菌体克隆载体 λ噬菌体载体类型 ①插入型载体（insert vector） ②取代型载体（replacement vector） （3）黏粒载体（cosmid vector） ②具有质粒DNA复制方式。 （4）M13噬菌体载体 结构：主要是对野生型M13基因组中的基因间隔区（IG），插入外源DNA进行改造。①插入β－半乳糖苷酶选择标记。②插入一小段多克隆位点区。 （5）噬菌质粒载体 ③可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。 （6）真核生物的克隆载体 酵母质粒载体 是利用酵母的2μm质粒和其染色体组分与细菌 质粒pBR322构建而成，能分别在细菌和酵母菌中进 行复制，是一种穿梭质粒。主要有三种。 （7）人工染色体 主要有：端粒、着丝粒、自主复制序列、有选择 标记的基因。 * 四、基因的定位诱变 1、寡核苷酸指导的诱变 （1）寡核苷酸引物诱变原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物变成为新合成的DNA子链的一个组成部分。因此所产生出来的新链变已具有发生突变的碱基序列。 定位诱变：是利用合成的DNA和DNA技术在基因精确限定的位点引入突变，包括删除、插入和置换特定的碱基序列，从而得到含变异碱基的突变基因。 （2） 寡核苷酸引物诱变过程 A、正链DNA合成。 B、突变引物的合成。 C、异源双链DNA分子的制备。 D、闭环异源双链DNA分子的富集。 E、转化。 F、突变体的筛选。 G、突变基因的鉴定。 （3）寡核苷酸引物诱变方法的局限性 突变效率是受多种因素制约的。使突变体子代的比例明显下降。 （4）提高寡核苷酸引物突变效率的办法 提高突变体比例的最有效的办法是抑制非突变体的生长。目前应用的最新方法主要有： A、Kunkel定点诱变法。 B、硫代磷酸诱变法。 2、盒式诱变 所谓盒式诱变（cassette mutagenesis）:就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片断，取代野生型基因中的相应序列。 这就好像用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样，故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式诱变。 3、PCR定位诱变 任何基因，只要知道两端及需要变异部位的序列，就可用PCR诱变去改造该基因的序列。简单易行，准确高效，常用的定位诱变方法。 PCR诱变方法 （1）变异部位位于基因的末端 只要5′端或3 ′端引物含有变异基因，就可以使PCR产物的末端引入变异。 （2）变异部位位于基因的中间 用重组PCR进行定位诱变，可在DNA片段任意部位产生定位诱变。 基本方法：在需要诱变部位合成一对含有变异碱基的互补引物，然后分别与5′引物和3′引物进行PCR，便可以得到两个PCR产物分别含有变异碱基，由于二者中间有一段序列彼此互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到变异的PCR产物。 图10－5 1 克隆载体 载体：是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内 表达或复制的运载工具。 克隆（clone）：原指一个亲本细胞经无性繁殖 产生无数个相同细胞子代群体的过程。 基因工程所说的克隆：是指一个亲本DNA分子产生 无数个相同DNA分子的过程。 穿梭载体：是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存在和复制的质粒载体。 表达载体：是指具有宿主细胞基因表达所需调节控制程序，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 克隆载体：以扩增外援DNA为目的的载体。 （6）从生物防护角度考虑是安全的。 （5）分子量小、拷贝数高。 （4）插入目的基因的幅度较宽。 （3）载体必须具有可供选择的遗传标记。 （2）载体必需具有若干限制酶的单一切割位， 便于外援DNA的插入。 （1）质粒克隆载体 质粒克隆载体的特性 ①具有独立的复制起点 ②含有多种限制酶的单一识别位点。 ③具有便于选择的标记 ④具有较高的拷贝数 ⑤具有较小的相对分量 质粒pBR322的结构特点 插入失活：常被用于检测含有外源DNA的重组体。 ①具有较小的分子量。 ③具有高的拷贝数。 λ噬菌体克