大杯伞柄多糖与菌丝体粗多糖免疫识别方法初探.docVIP

大杯伞柄多糖与菌丝体粗多糖免疫识别方法初探 　　摘要 采用热水（80 ℃）提取和75%乙醇沉淀、Sepharose CL-4B凝胶过滤及DEAE Sepharose CL-4B阴离子交换等方法分离纯化大杯伞 （Clitocybe maxima） 柄粗多糖，获得伞柄多糖纯品，制备多糖抗体；采用热水法提取大杯伞菌丝体粗多糖。用碳二亚胺法将纯化伞柄多糖与牛血清白蛋白进行共价化学偶联，并将偶联产物（拟糖蛋白）免疫兔子以制备抗血清，以酶联免疫法检测抗体滴度。依据该抗体与来自相同菌株的菌丝体粗多糖免疫反应差异对这两种多糖进行免疫识别，结果表明：经过亲和层析纯化后，第六次免疫抗血清对伞柄多糖的抗体滴度可达64 K，而且对菌丝体粗多糖反应呈阴性，显示该抗体可识别这两种多糖之间的结构差异。 　　关键词 大杯伞； 伞柄多糖； 菌丝体粗多糖； 分离纯化； 抗体制备； 免疫识别 　　大杯伞（Clitocybe maxima）属于珍稀食用菌，又称猪肚菇、大杯蕈、大漏斗菇、笋菇等[1]。它营养丰富、味道鲜美，在夏季出菇，具有广阔的开发前景。大杯伞柄长达10 cm以上，柄粗1.5～2.5 cm，菌柄的生物量约占生物总量40%～50%[2]，其粗纤维含量高，难以食用，通常作为废弃物处理。但是，福建省农业科学院农业工程技术研究所的前期研究表明，大杯伞柄多糖具有较强的抗氧化生物活性[3]。因此，利用大杯伞柄开发食用菌多糖类保健食品可以变废为宝、增加效益。 　　多糖的结构分析方法通常可分为化学法、物理法（或仪器分析法）以及生物法三大类。若将这三种方法组合，则可以很好地完成多糖结构完全解析的任务[4]。但是，国内外的食用菌多糖结构研究目前通常只采用化学法和物理法[5]，虽然能够从宏观上对大分子多糖结构进行解析，但是对多糖内部的微小结构差异（特别是空间结构差异）难以进行识别。因此，食用菌多糖的进一步深入研究需要借助包括免疫法在内的生物学研究方法。 　　多糖的免疫研究法在医学领域有着广泛的应用，可应用于病原体多糖疫苗的开发研究[6-7]。一般而言，多糖缺乏免疫原性，属于不完全抗原或半抗原，所以必须将多糖和蛋白质偶联制成完全抗原，而后免疫动物以获取相应的多糖抗血清[8]。但值得注意的是，食用菌多糖与病原体荚膜多糖抗体制备过程有所不同，荚膜多糖的分子量一般在几千到几万道尔顿之间，其偶联物溶解性比较好，制备过程相对容易；相比较而言，食用菌多糖分子量一般在几十至几百万道尔顿之间，其偶联物属于高分子量糖蛋白，需要选择合适的偶联方式来保证反应中间产物以及偶联物有较高的溶解度，使得偶联反应过程和后续的偶联产物纯化工作能够进行。 　　笔者制备大杯伞柄多糖抗体，并尝试将其应用于食用菌多糖的免疫识别研究。 　　1 材料与方法 　　1.1供试菌株及动物 　　大杯伞（C. maxima）菌株及其伞柄由漳州福建嘉田农业开发有限公司提供。 　　新西兰雌性大白兔（4月龄，2.1 kg）购自上海市松江区车墩实验动物良种场，许可证号为SYXK（沪）2008-0045。 　　1.2主要仪器与试剂 　　蛋白质纯化仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）、LC10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）、ST-360酶标仪（上海科华实验系统有限公司）。蛋白-多糖偶联剂SULFO-NHS（美国Thermo Scientific公司）；rProtein A Sepharose亲和层析预装柱和生化测定试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）； UltrahydrogelTM2000 GPC水溶性凝胶色谱柱（美国Waters公司），RID-10A示差折光检测器（日本岛津公司）；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司）；其余化学试剂均为国产市售AR级。 　　郑恒光，等：大杯伞柄多糖与菌丝体粗多糖的免疫识别方法初探 　　1.3大杯伞柄的化学组成分析 　　依据国家标准GB5009系列（2010版）测定[9]。 　　1.4大杯伞菌丝体培养及粗多糖提取 　　按照文献[3]的方法培养大杯伞菌丝体，并用热水法从菌丝体中提取多糖，制得菌丝体粗多糖冻干粉。 　　1.5大杯伞柄多糖的提取及纯化 　　采用乙醇沉淀、Sevag法、凝胶过滤、离子交换等方法，按照文献[3]的步骤进行多糖的提取和纯化，制得大杯伞柄多糖冻干粉。 　　1.6大杯伞柄多糖纯度检测 　　采用高效排阻色谱法检测，使用UltrahydrogelTM2000 GPC水溶性凝胶色谱柱， RID-10A示差折光检测器，流动相为：添加了0.13 moL/L NaCl 的0.025 moL/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0），流速0.5 moL/L，进样量10 μL，检测时间30 min，柱温25 ℃。 　　1.7大杯伞柄多糖-蛋白偶联物的化学合成