姜曲海猪肺泡巨噬细胞分离培养与鉴定.docVIP

姜曲海猪肺泡巨噬细胞分离培养与鉴定 　　摘要：通过冷PBS气管灌洗法分离培养姜曲海猪肺泡巨噬细胞（PAM），进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。从健康20日龄仔猪，分离得到PAM。以10% RPMI-1640培养液对PAM进行培养，观察细胞形态，用墨汁吞噬和免疫荧光检测了PAM的吞噬功能和纯度，比较冻存前和复苏后细胞的活率和细胞吞噬功能，以获得一批高纯度的PAM，用于猪体外呼吸道疾病发病机理的研究。 　　关键词：猪肺泡巨噬细胞（PAM）；分离；培养；鉴定 　　中图分类号： S858.286.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0163-03 　　通信作者：赵旭庭，硕士，教授，研究方向为地方畜禽遗传资源的保护与利用。E-mail：825587062@。肺泡巨噬细胞是机体抵御外来微生物侵袭肺脏的第一道防线，一直是研究肺部抗感染模型的重要细胞类型[1]。猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）是猪肺脏重要的功能细胞，它不仅可吞噬侵入肺脏的粒子，参与肺脏的防御和免疫，而且还能分泌大量的生物活性物质，维持肺脏和机体正常的生理活动[2]。目前，肺泡巨噬细胞的分离培养以小动物，如大鼠、小鼠、豚鼠居多，国内关于猪肺泡巨噬细胞的分离培养方法的报道很少。猪肺泡巨噬细胞属于不繁殖细胞群，为多代培养，难以在体外长期生存[3]。随着体外分离细胞技术的不断发展，巨噬细胞的提取方法有多种，又由于研究目的不同，在体内提取细胞的部位也不尽相同[4-5]，巨噬细胞在肝、脑等实质器官以及腹腔等空腹部位以不同的形式分布，不少文献报道从多种组织器官中分离和纯化巨噬细胞[6]。为获得存活率高，纯度高，吞噬功能强的PAM，并节约试验材料、减少因细胞来源不同造成的试验误差，本试验对地方猪姜曲海猪PAM进行了分离、纯化、鉴定和冷冻保存，探索PAM生长和凋亡周期，观察生长过程中形态和吞噬能力的变化。为利用PAM在体外研究地方猪呼吸道疾病及其他肺部疾病的治病机理探究等奠定基础。 　　1试验方法 　　1.1试验材料 　　20日龄健康姜曲海猪由江苏姜曲海种猪场提供。 　　1.2试验试剂 　　RPMI-1640培养液和胎牛血清FBS为Giboc公司产品，DMSO为国产试剂，1 ∶100稀释的小鼠源抗MAC387单抗（abcam，ab22506），1 ∶200稀?的FITC标记的山羊抗小鼠IgG（Bioworld）。 　　1.3试剂的配制 　　RPMI-1640完全培养液：RPMI-1640培养液，10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（PS）、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%丙酮酸；细胞冻存液：70% RPMI-1640培养基，20% FBS，10% DMSO；墨汁：4.5 mL PBS加入0.5 mL墨汁，均匀混合后高压灭菌。 　　1.4试验方法 　　1.4.1PAM的分离将试验仔猪置于无菌室内解剖台上，采取股动脉放血致死，剖开胸腔，小心剥离并结扎气管后连同心脏取出完整的肺脏，用PBS充分清洗肺脏表面，清洗血块污垢，从气管往肺脏注入双抗PBS 50～100 mL，轻轻拍打表面，1～2 min后回收支气管肺泡灌洗液，重复灌洗2～3次，直到共回收200 mL灌洗液，将灌洗液经4层无菌纱布过滤，去除脂肪组织块等。1 000 r/min离心10min，倒掉上清，用PBS重悬细胞，重复洗涤2次，RPMI-1640培养液洗涤1次，离心去上清，得到肺泡巨噬细胞。 　　1.4.2原代PAM的培养用RPMI-1640完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度至2×106个/mL，吸取2 mL铺于6孔板，置于5% CO2，37 ℃培养箱，培养2 h后从细胞培养箱中取出细胞板，弃掉旧培养液，用PBS轻轻润洗2次，加入新的RPMI1640完全培养液。以后每24 h更换1次新鲜培养液。连续培养20 d，观察记录细胞培养的全过程。 　　1.4.3PAM存活率和纯度鉴定 　　台盼蓝染色检测PAM细胞的存活率将0.4%的台盼蓝染液与等体积的细胞悬液混合，染色2～3 min，取1滴混合液加入细胞计数板内，在显微镜下计数着蓝色和未着色的细胞。计算细胞存活率，细胞存活率=未着色细胞数/（着色细胞数+未着细胞数）×100%[1]。 　　免疫荧光法检测PAM吸去培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗，加入4%多聚甲醛固定30 min，经0.2% Triton-100穿透20 min后，用PBS清洗3次，每次5 min，加入一抗（1 ∶100 稀释的小鼠源抗MAC387单抗），室温孵育2 h，加入二抗（1 ∶200稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG），室温孵育1 h后，加入终浓度为10 μg/L的Hoechst33342，室温染色3