姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性机制研究お.docVIP

姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性机制研究お 　　[摘要]为探索姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性的机制，该研究采用掌叶半夏毒针晶诱导的小鼠腹腔炎症模型，观察姜辣素对小鼠腹腔炎症渗出液中炎症介质PGE2的影响；采用大鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型，以上清液中TNFα和IL1β为指标，研究姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶的致炎作用；采用扫描电镜法观察姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激后巨噬细胞表面形态的改变；采用巨噬细胞中性粒细胞共培养模型，考察姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对中性粒细胞迁移的影响。结果显示，姜辣素可以显著抑制掌叶半夏毒针晶所致的小鼠腹腔渗出液中PGE2的生成；姜辣素可以显著抑制掌叶半夏毒针晶诱导巨噬细胞释放炎症因子，并具有一定的量效关系；扫描电镜显示，姜辣素可以显著抑制巨噬细胞吞噬掌叶半夏毒针晶及细胞膜破损，并能显著抑制掌叶半夏毒针晶诱导的中性粒细胞迁移。姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶刺激性毒性的机制可能是抑制了包括巨噬细胞激活、炎症因子释放、中性粒细胞迁移聚集的致炎毒性。 　　[关键词]姜辣素； 掌叶半夏； 巨噬细胞； 炎症因子； 扫描电镜； 中性粒细胞趋化 　　掌叶半夏，又名虎掌南星，为天南星科植物掌叶半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥块茎，最早记载于《神农本草经》[1]，为天南星科有毒中药且毒性最强，对口腔、咽喉等具有强烈的刺激性[2]。 　　本课题组前期研究证实，掌叶半夏刺激性毒性成分主要是蛋白和草酸钙结合形成的针晶复合物，被称为“毒针晶”[3]，电镜下毒针晶极细长、两头尖锐、质坚韧，具倒刺、凹槽[4]。毒理研究显示，掌叶半夏的毒针晶在机体表现为刺激性炎性反应。误食后在口腔咀嚼或吞咽的作用力下，大量毒针晶可刺入口腔及咽喉的黏膜组织，毒针晶刺入的同时针晶上的毒蛋白进入组织细胞诱发急性炎症，故掌叶半夏的刺激性毒性是毒针晶刺入的机械刺激和毒蛋白化学刺激的双重作用[56]。 　　生姜是姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的根茎。生姜味辛，性温；归肺、胃、脾经；功效为发散风寒、温中止呕、化痰解毒，民间多用于解药物和食物中毒。生姜及生姜提取物具有广泛的药理作用，包括调节免疫、抗炎、镇痛、抗肿瘤、止呕等药理作用。生姜的块茎中含有多种化学成分，主要包括挥发油类、姜辣素、二苯基庚烷，其中姜辣素类成分是生姜抗炎的有效成分[7]。 　　课题组前期研究显示，掌叶半夏刺激性毒性与其刺激巨噬细胞相关[810]。炎症反应最重要的功能是将炎症细胞输送到炎症局部，白细胞的渗出是炎症反应最重要的特征，所以中性粒细胞迁移是炎症反应中至关重要的一步，起到主要的防御作用。故本文采用腹腔注射掌叶半夏毒针晶致小鼠腹腔炎症模型、大鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）体外培养模型及体外中性粒细胞共迁移模型，深入研究姜辣素拮抗掌叶半夏毒针晶对巨噬细胞的致炎作用，为深入阐释生姜解掌叶半夏及整个天南星科有毒中药的毒性作用机制提供依据。 　　1材料 　　BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；LDZ2（Y）低速离心机（北京京立有限公司）；Spectra Max 190酶标仪（美国AD公司）；二氧化碳培养箱（美国NUAIRE公司）；LEICA MPS 60 DM显微镜系统（德国莱卡公司）； IB5离子溅射仪（日本日立公司）； SEM505扫描电子显微镜（荷兰飞利浦公司）。 　　胎牛血清（美国WISENT 公司）；RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司）；trasnwell小室，48孔培养板（美国Corning公司）；DextranT500（葡聚糖）（美国Pharmacia公司），Percoll分离液；快速瑞姬氏染液（南京建成生物工程研究所）；TNFα，IL1β ELISA试剂盒（美国Ebioscience公司）；Mouse PGE2 ELISA试剂盒（南京翼飞雪生物科技有限公司）；台盼蓝（南京化学试剂有限公司）；非特异性酯酶染液（南京建成生物有限公司）；戊二醛（电镜级，美国Alfa公司）；乙醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；生理盐水（南京小营药业集团）；PBS缓冲液（实验室自制，高压蒸气灭菌）；羧甲基纤维素钠（化学纯，国药集团化学试剂有限公司），相关溶液均使用去离子水配制。 　　SD大鼠，SPF级，雄性，体重200～220 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK（浙ICR小鼠，清洁级，雄性，体重20～22 g，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号SCXK（苏 　　掌叶半夏采自河南省禹州市，药材经南京中医药大学王春根教授鉴定为天南星科植物掌叶半夏Ppedatisecta的块茎。生姜药材购自南京市农贸市场，经南京中医药大学刘训红教授鉴定为姜科植物姜的新鲜根茎。