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spink8基因对食管癌EC9706细胞增殖及 迁移的抑制作用-遗传学专业论文
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学位论文作者: 日期: 年 月 日
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学位论文作者: 日期: 年 月 日
摘
摘 要
spink8 基因对食管癌 EC9706 细胞增殖及迁移的抑制 作用
研究生:孙 艳
导 师:郑 红 教授
郑州大学基础医学院
医学遗传与细胞生物学系
河南 郑州 450001
摘 要
研究背景和目的
食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,全世界每年约有 20 万人死于食 管癌,对人类的生命和健康造成极大威胁。食管癌的病因尚未完全明了,通过 多途径探索,发现其发病与遗传因素、亚硝胺慢性刺激、炎症及创伤、粮食和 蔬菜中的微量元素含量等相关,但其确切致病机制有待深入研究。EC9706 细胞 是来源于食管癌组织的细胞株,在体外以 EC9706 细胞为研究对象,对于探讨和 认识食管癌的生物学行为有重要的价值。
Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(serine protease inhibitor kazal type, SPINK),成员包括 SPINK1~12 等多个亚族,该家族成员多与疾病和肿瘤相关, 如 spink1 与胰腺癌相关,spink2 与男性不育相关,spink7 为食管癌相关基因等。 spink7 已被证实为肿瘤抑制基因,具有调控细胞增殖、诱导凋亡及抑制肿瘤迁移 和侵袭等功能。以往的研究发现,食管组织内有 SPINK8 蛋白的内源性表达,同 时另一项全基因组比对结果显示,spink8 基因相对表达量在成人食管癌组织比正 常食管及癌旁组织明显减少。但有关 SPINK8 蛋白的功能研究国内外文献报道甚 少。spink8 与 spink7 具有同源性,且模拟三维结构相似,但两种蛋白的氨基酸序 列有部分差异,推测这两种蛋白特异性抑制的蛋白酶可能有所不同。
本研究将根据 NCBI 数据库记录的 spink8 cDNA 序列构建能够表达 shRNA
的重组质粒,并应用脂质体介导,将干扰重组质粒和过表达质粒分别转染 EC9706
I
细胞,观察 EC9706 细胞中 spink8 基因的表达情况,并讨论沉默 spink8 内源性
基因及过表达 SPINK8 蛋白对 EC9706 细胞增殖、迁移和克隆形成能力的影响。 实验将探索 spink8 是否属于抑癌基因,并初步阐述其作用方式,为食管癌的发 生发展提供可能得新的理论机制,以求为治疗提供新的作用靶点。 材料和方法
1.以 spink8 的 mRNA 已知序列为靶点,构建 pGenesil-SPINK8 重组质粒及 阴性对照质粒。
2. 重 组 干 扰 质 粒 pGenesil-SPINK8 、 阴 性 对 照 质 粒 、 重组 过 表 达 载体 pEGFP-C1-SPINK8 和空质粒 pEGFP-C1 分别转染 EC9706 细胞株,细胞分为 5 组,即未处理组、干扰组、阴性对照组、空载体组和过表达组,分别用半定量 RT-PCR 和 Western Blotting 检测对蛋白表达水平进行鉴定。
3.绘制 MTT 生长曲线检测转染后各实验组细胞的增殖能力。
4.克隆形成实验检测转染后各实验组的细胞克隆形成能力。
5.划痕愈合实验检测转染后各实验组细胞的体外迁移能力。
6.统计学分析:所有数据均由 SPSS17.0 软件处理,定量资料应用均数±标 准差(Mean±SD)表示;多组均数差异的比较采用单因素方差分析(ANOVA), 并用 LSD-t 法进行组间比较;以 α=0.05 为显著性检验水准。
结果
.成功构建 pGenesil - SPINK8 重组质粒,并且应用限制性内切酶 SalⅠ进行 消化,证实重组质粒能被切出长约 400 bp 的小带;测序结果与设计的完全相符。
. pGenesil - SPINK8 重组质粒转
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