生化chapter+03-07+amino+acid+and+proteins-2.pptVIP

* * * 氨基酸的释放量（摩尔数） 反应时间 Gly Ser Val 判断序列 -Val-Ser-Gly-COOH ②羧肽酶水解法 3.2.3 C-末端氨基酸测定 最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护还原时生成的半胱氨酸巯基，以防它重新被氧化。 二硫键拆开后形成的个别肽链，可能用纸层析、离子交换柱层析、逆流分溶、区带电泳等方法进行分离。 3.2.4 二硫键拆开和肽链分离 SH +SH S S HOCH2CH2SH ICH2COOH 涉及反应 pH8.0~9.0,室温 S CH2COO 3.2.4 二硫键拆开和肽链分离 ①化学法 有溴化氰法、部分酸水解法、羟胺法和N-溴代琥珀酰亚胺法等。 ②酶解法 有较强专一性，水解产率也较高。 常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等。 处理后得到的肽段，主要通过凝胶过滤法分离，常辅以离子交换层析法。 3.2.5 肽链部分水解和分离 ①主要是Edman降解法。P. Edman于1950年首先提出。 Edman降解试剂（PITC）与多肽链的游离末端氨基作用，降解反应分偶联、环化断裂和转化三个步骤。 3.2.6 肽段氨基酸顺序测定 ②酶解法 主要是肽谱重迭法，是在化学法所得结果的前期下进行的氨基酸序列分析。 测定多肽链中分离出来的各个小肽段，可以应用化学方法或酶学方法测出其中的氨基酸顺序。然后比较用不同方法获得的几套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此有重叠的部分，确定每个肽段的适当位置。拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。 3.2.6 肽段氨基酸顺序测定 肽 顺序 A1 B1 A2 B2 A3 B3 A4 Ala.Phe(丙-苯丙) Ala.Phe.Gly.Lys(甘-赖) Gly.Lys.Asn.Tyr(-天冬酰-酪) Asn.Tyr.Arg(-精) Arg.Trp(-色) Trp.His(-组) His.Val(-缬) 十肽顺序 Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Trp.His.Val 3.2.6 肽段氨基酸顺序测定 一般可用蛋白酶或酸直接水解原来的蛋白质，从部分水解产物中分离出含有二硫键的肽段，所得到的肽段混合物可用Brown及Harltay的对角线电泳技术进行分离，确定二硫键位置。 一般用胃蛋白酶水解原来的含二硫链的蛋白质。因为胃蛋白酶专一性较低，切点多，这样生成的肽段（包括含有二硫桥的肽段）都比较小，后面的分离、鉴定工作均比较容易进行。其次是胃蛋白酶的pH在酸性范围（1～2），有利于防止二硫键发生交换反应而造成麻烦。 3.2.7 二硫键位置测定 3.2.7 二硫键位置测定 Brown和Hartlay对角线电泳图解 + - + - 第二向 第一向 a b pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂产生的肽段。 3.2.7 二硫键位置测定 4.1 一级结构的生物学意义 生物形态与分子结构在进化过程中是向着多样化和专一化方向发展的。 蛋白质的合成是受核酸控制的，但是随着生物环境的变化，DNA也会发生偶然的突变，这将必然影响蛋白质的生物合成，引起蛋白质某些氨基酸的变化。 氨基酸的改变可能导致蛋白质的生物学功能丧失或更加完善。 4.2 一级结构的进化 β半乳糖苷酶是一种催化半乳糖水解为单糖的水解酶蛋白，在细菌、真菌、动物和人体内均被发现。 来源于细菌中的β半乳糖苷酶为四聚体。 每个亚基又有五个不同的结构域组成。 在第三个结构域中存在α/β或称为“TIM”桶的结构，酶的活性中心就存在于该结构的C末端。因此，该酶蛋白具有四个活性中心。 4.3 蛋白质的一级结构与高级结构 β半乳糖苷酶的立体结构 4.3 蛋白质的一级结构与高级结构 血红蛋白是高等动物体内负责运载氧的一种蛋白质。 人体血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基（141个残基）和两个β亚基（146个残基），可以自动组装成α2β2的形态。 每个亚基的血红素结合1分子氧，血红蛋白四聚体可结合4分子氧。 4.3 蛋白质的一级结构与高级结构 分子病是指由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，从而造成生物体生理功能变化而引起的疾病，镰刀形红细胞贫血病的血红细胞成镰刀状，容易发生溶血，从而造成严重贫血。 原因是患者血红蛋白（HbS）与正常人血红蛋白（HbA）β亚基中有一个氨基酸残基不同。 β链N端氨基酸序列 1 2 3 4 5