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活细胞内单分子荧光成像方法 　　摘要 文章介绍近年来新发展的几种重要的活细胞内单分子荧光成像方法，如转盘式共聚焦最微术、全内反射荧光显微术、荧光共振能量转移技术等。通过介绍它们的原理、特点和在活细胞内单分子行为研究中的应用实例，展示了这些新方法在生命科学领域广阔的应用前景。 　　关键词 单分子，荧光，成像，活细胞 　　 　　1 引言 　　 　　在原子和分子水平上观测和操纵物质曾是几代科学家的梦想。直到20世纪80年代扫描隧道显微术(scanning tunneling microscopy，STM)的发明，这一梦想才被实现。近二十年来，单分子技术迅速发展，从一开始只能在低温、真空条件下实现单分子探测，发展到能在常温的溶液中或界面上研究单分子的反应动力学过程和机制，甚至实时记录这些过程。将这些单分子技术进一步应用到生物分子体系，人们发现了很多用传统的基于分子浓度变化的生物化学或药理学实验所得不到的现象，获得了很多被以往的系统平均(ensemble averaging)方法所掩盖的信息，使得离体情况下和活细胞内的生物单分子研究越来越受到重视。 　　 　　活细胞内的生物单分子研究尤其重要。然而这意味着要在不影响细胞正常生命活动的前提下去实现单分子的探测，因而在众多单分子技术中，人们首先想到的是光学方法，因为只有光子对待测体系的扰动最为轻微；而在各种光学方法中，最有发展潜力的是荧光成像方法，一则荧光检测的灵敏度高，二则成像可以实现“可视化”(visualization)，实现人们“亲眼目睹”活细胞内生物单分子动态行为的梦想。但是，活细胞内的单分子荧光成像仍然面临着前所未有的挑战，因为活细胞不仅是个高散射体，而且含有大量自发荧光物质。所以，活细胞内的单分子荧光成像方法不仅要求高灵敏度和高分辨率，而且还要求有足够高的图像信噪比和足够快的成像速度。 　　近年来在活细胞内的单分子荧光成像研究中取得显著应用成果的方法有：转盘式共聚焦显微术(spinning disk confocal microscopy，SDCM)、全内反射荧光显微术(total internal reflection fluorescencemicroscopy，TIRFM)、荧光共振能量转移术(fluores-cence resonance energy transfer，FRET)等。本文主要介绍这三种方法的原理、特点以及它们在活细胞内单分子行为研究中的一些应用实例。 　　 　　2 转盘式共聚焦显微术(SDCM) 　　 　　2．1 SDCM的原理及其特点 　　SDCM是把共聚焦激光扫描显微术(confocal la-ser scanni’ng microscopy，CLSM)的高纵向分辨率和普通宽场荧光显微术的成像速度快两个优点集于一身的一种新技术，要阐明它的原理，首先要从CLSM的原理人手。 　　2．1．1 CLSM的基本原理 　　CLSM的基本原理是利用一对共轭的针孔(pin-hole)进行“空间滤波”，从而将焦平面以外的杂散光滤除以提高纵向分辨率，实现非侵入式的“光学切片”(optical sectioning)。这两个针孔分别位于光源和探测器之前，称为光源针孔和检测针孔；所谓“共轭”，是指物镜焦平面上的点发出的光通过一系列的透镜最终可同时聚焦于这两个针孔，此即“共焦”之意。目前常用的CLSM多以光电倍增管(photomuitiplier tube，PMT)为探测器，以激光为激发光源，利用大数值孔径(numerical aperture，N.A.)的显微物镜将通过光源针孔的入射光聚焦在物镜焦平面上一个很小的点上，由于探测针孔的存在，PMT只收集处于物镜焦点上的样品发出的荧光。利用光学扫描振镜使入射光点在物镜焦平面上进行逐点逐行扫描，就能得到焦平面样品的荧光图像，称为一张“光学切片”(optical section)；再利用步进马达控制样品台纵向移动，即改变物镜焦平面在样品中的位置，便可采集到样品中不同深度的一系列光学切片，从而获得样品的三维信息。CLSM的横向分辨率约为100-200nm，纵向分辨率可达500nm，大大优于普通非共焦方式的荧光显微成像技术；同时共焦针孔的应用也极大地提高了图像信噪比。这些优点使CLSM被广泛应用于细胞生物学的研究，尤其是亚细胞层次空间结构和功能的研究。 　　 　　然而CLSM采用的是逐点扫描成像方式，成像速度受到很大限制(目前多数商用的CLSM扫描一张图像约需1 s)，因而尽管它具有很高的分辨率和图像信噪比，可以实现单分子荧光成像，但要想捕捉到活细胞中单个荧光分子的运动还是很难。近年来出现的SDCM是利用CLSM中最关键的共焦针孔原理发展起来的，但采用了面成像方式，成像速度达到甚至超过视频速度的