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水稻DREB1基因植物表达载体构建 　　摘要：研究提取低温处理的水稻幼苗总RNA，用DREB1基因特异引物通过RT-PCR扩增出1029 bp的片段。序列分析结果表明，该克隆序列与GenBank上的DREB1基因序列同源性达100%。利用HindⅢ酶切位点将含有35s启动子、OsDREBI和NOS终止子的基因片段正向插入到pZY101载体中，并采用冻融法热击转化到农杆菌EHA101中，为通过遗传转化方法研究DREB1的功能奠定基础。 　　关键词：水稻DREB1 基因 过表达 　　干旱、低温、盐害等非生物胁迫严重影响植物的生长发育和产量，转录因子在调节植物生长发育及对环境胁迫的适应性方面起着非常重要的作用。干旱应答元件结合蛋白（dehydration responsive ele-ment binding protein，DREB）类转录因子是植物体内一种非常重要的转录因子，能特异性启动子中的DRE/CRT顺式作用元件，激活下游相关逆境基因的表达，在植物对非生物胁迫的分子反应中起着重要的调控作用。1998年自Liu等首次从拟南芥中克隆到DREB基因，并发现该类基因的过量表达能有效提高转基因植物的抗逆性以来，DREB基因的克隆、功能鉴定及其作用机制等已经成为目前植物抗逆基因工程的研究热点。 　　研究从低温处理的水稻幼苗中克隆DREB1基因，构建水稻DREB1基因的过表达载体，以期在后期研究中通过农杆菌介导转入大豆基因组中，获得水稻DREB1基因过表达转基因大豆植株，为进一步研究DREBJ的功能和获得有抗逆性的新品种奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1供试材料 　　植物：水稻品种9311幼苗。 　　载体：pGEM-T Easy质粒，采购自Promega公司；pUC18载体，由华南农业大学农学院张桂权教授实验室馈赠；双元载体pZY101、pZY102由美国密苏里大学张展元教授馈赠。 　　菌株：大肠杆菌DH5α由华南农业大学农学院张桂权教授实验室惠赠，农杆菌EHA101由美国密苏里大学张展元教授惠赠。 　　1.2水稻总RNA的提取 　　参照TRIzol一步法分离总RNA。 　　①在液氮中研磨100 mg材料，研碎后转入到含1 mL TRIzol试剂的1.5 mL离心管中，充分混匀： 　　②室温放置5 min； 　　③每支管中加入0.2 mL新鲜氯仿，剧烈振摇15 s，25℃温育2～3 min； 　　④≤12，000 rpm，4℃，离心15min； 　　⑤把上方无色的水相转移到一个新的1.5 mL离心管中，用0.5 mL异丙醇沉淀RNA，室温放置10min； 　　⑥≤12，000 rpm，4℃，离心10min； 　　⑦去上清，将RNA沉淀用1 mL 75%乙醇清洗2次，超净台吹干； 　　⑧将RNA沉淀溶于适量DEPC.ddH20中，通常为50～100 μL，60℃水浴10 min，-70℃保存； 　　⑨将提取好的RNA样品（0.5～1μg），用1/3倍的TAE缓冲液配置的琼脂糖胶，在300 v电压下电泳5 min，检测RNA提取的质量； 　　⑩用分光光度计分别检测RNA在260 nm和280 nm处的分光光度值以此来确定RNA的纯度和浓度。同时取1μL RNA样品于1.2%的甲醛变性胶上进行电泳检测。 　　1.3 RT-PCR 　　①反转录第1链cDNA的合成 　　参照RT-PCR试剂盒（Promega）说明书进行。 　　②PCR合成第2链 　　取第1链稀释2倍的产物1 μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。 　　根据OsDREBl的cDNA序列设计引物。引物序列如下： 　　OsDREB1-1：5CTGATAGCCTCCTTGATTTT3’； 　　OsDREB1-2：5AAGACGAAAACCGTAAATG 　　③将培养物转移至50 mL离心管中，冰浴10min，4℃，4，000 rpm离心10min，收集菌体； 　　④沉淀用20 mL冰预冷的无菌100 mmol/LCaCl2重悬，冰浴10min； 　　⑤4℃，4，000 rpm离心10min，收集菌体； 　　⑥沉淀再用2 mL 100 mmol/L CaCl2（含15%的甘油重悬，得到感受态的菌体；每管50μL分装后，可放于-70℃冰箱中保存，备用。 　　连接产物转化大肠杆菌： 　　①取感受态细胞一支，加入适量的连接产物，用枪头轻轻吹吸混匀后，冰浴30 min，42℃热激90 s，冰上迅速冷却2 min，加入600 μL LB培养基，37℃，150 rpm温育45min； 　　②涂布适量的细胞于筛选培养基平板上，超净台上吹干培养基表层液体，37℃倒置平板培养12～16 h，筛选抗性菌落。 　　1.6重