波尔山羊MC4R胞内3环基因片段单核苷酸多态性对体重影响.docVIP

波尔山羊MC4R胞内3环基因片段单核苷酸多态性对体重影响 　　摘要：为探讨黑素皮质素受体4（melanocortin receptor-4，MC4R）基因多态性对波尔山羊生长性状的影响，对波尔山羊MC4R基因进行了克隆测序，筛选多态性位点。结果表明：MC4R胞内3环基因片段存在2个碱基颠换，分别是编码区663 bp处C/A颠换、693 bp处C/T颠换；其中693 bp处C/T存在于Csp6Ⅰ酶切位点内，以此建立了基于 Csp6Ⅰ 酶切的PCR-RFLP检测方法，并对163只波尔山羊进行检测分析；在受检波尔山羊中检测到CC、CT 2种基因型，2种基因型在波尔山羊各月龄体重方面差异均不显著，且在群体中表现为低度多态，群体遗传杂合度较低，表明C693T位点在波尔山羊群体中的遗传一致性较高。 　　关键词：黑素皮质素受体4；克隆；PCR-RFLP；波尔山羊；生长 　　中图分类号： Q343.1+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0013-03 　　黑素皮质素受体-4（melanocortin receptor-4，MC4R）分布于动物脑组织和肾上腺髓质，是从动物下丘脑腹内侧核分泌的一种肽类物质[1]，其主要作用是通过与脑部分泌的天然内源配体α-促黑激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）结合，从而抑制体重增加[2]。1993年Gantz等最先克隆出人的MC4R基因，并将其定位于人染色体18q21.3[3]。1997年Huszar等首次证明了MC4R在能量平衡中的关键作用，即遗传敲除MC4R基因的小鼠出现遗传性肥胖，表现多食、肥胖、胰岛素分泌过多等症状[4-5]。此后又有大量研究发现，MC4R在家畜的背膘厚、日增重、采食量等生长性状中具有重要生物学活性，可作为选择动物生长性状的遗传标记。本研究对波尔山羊MC4R基因进行了克隆和测序，寻找波尔山羊MC4R基因的多态性位点，分析其多态性与波尔山羊体重的关联，以期为山羊分子育种提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　163只波尔山羊样本由江苏省农业科学院六合动物实验基地统一饲养管理，营养水平以及管理水平保持一致。各月龄波尔山羊体重资料均由该基地提供。对各个体采集耳组织样，置冰桶中带回实验室，-20 ℃保存。 　　1.2 组织DNA提取 　　组织样DNA的提取采用酚/仿抽提法，TE Buffer 溶解后-20 ℃保存。 　　1.3 MC4R基因扩增 　　根据GenBank：EU622853.2设计引物。上游引物序列：TCCAAGTGATGCCGACCAG，下游引物序列：CTGGGCACTGCTTCACATC。PCR反应总体系20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×缓冲液2 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。 　　1.4 克隆与测序 　　PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，随机选取10只波尔山羊的PCR产物用TaKaRa胶回收试剂盒回收后与 PMD-19T 载体连接，16 ℃培养过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞中，37 ℃培养16 h，挑阳性克隆送上海英骏公司测序。 　　1.5 突变位点筛选 　　将11个阳性克隆的测序结果与GenBank序列对比，确定突变位点。 　　1.6 PCR-RFLP分析 　　1.6.1 目的基因扩增 根据测序结果选择其中一个突变位点（位于Csp6Ⅰ识别序列内），设计1对引物扩增MC4R基因Csp6Ⅰ位点上游158 bp，下游80 bp，共238 bp序列，上游引物序列为GTGTCGGGCGTCTTGTTC，下游引物序列为AGCAGACGACGAAGACCC。PCR反应总体系为20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×缓冲液2 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 s，35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色检测扩增结果。 　　1.6.2 基因型的确定 采用Csp6Ⅰ对PCR扩增产物进行酶切。酶切反应体系16 μL，含PCR产物4 μL，10