不同功能肽修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

上海 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 陈舜胜 上海海洋大学 教授 主席 陶妍 上海海洋大学 教授 委员 杨靖亚 上海海洋大学 副教授 委员 王勇 中国科学院 植物生理生态研究所 教授 委员 沈彦萍 上海沈李科工贸 有限公司 研究员 委员 曲映红 上海海洋大学 副教授 秘书 答辩地点 上海海洋大学食品 学院 A210 答辩日期 2015.6.10 不同功能肽修饰的聚乙烯亚胺衍生物 作为基因载体的研究 摘 要 基因治疗的本质是用基因载体携带目的基因进入靶细胞，通过遗 传学或分子生物学技术以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，从 而达到治疗各种疾病的目的。基因治疗作为一种新的治疗手段，可以 治疗包括癌症、心血管疾病和遗传性疾病等多种疾病，目前的研究主 要集中于肿瘤的治疗。寻找安全高效的基因载体是基因治疗的关键之 一。基因载体分为病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。非病 毒载体通过理化方法介导基因转移，具有无传染性、化学结构可控、 不限制载体容量及容易于大量制备等特点。与病毒载体相比，它还具 有低毒性、低免疫性、所携带的目的基因不会整合至宿主细胞基因组 等优势。因此，非病毒载体 领域近年来被广泛研究。聚乙烯亚胺 （polyethylenimine, PEI）因其“质子海绵作用”而成为研究最广泛的 一种聚阳离子非病毒基因载体。然而 PEI 在应用中存在三个突出问题： 第一，聚合物的转染效率与细胞毒性不一致：即高分子量 PEI 转染效 率高，细胞毒性大；而细胞毒性小的低分子量 PEI，转染效率低。第二， 体液稳定性与穿膜能力不一致：为了增加 PEI 体液稳定性而增加聚合 物的亲水性，会导致 PEI 的穿膜能力降低，从而不利于目的基因的递 送。第三，PEI 的细胞靶向性差：PEI 通过静电相互作用与细胞结合， I 因此无法识别特定细胞，靶向性欠缺。 普 朗 尼 克 (Pluronic) 是 聚 氧 乙 烯 — 聚 氧 丙 烯 — 聚 氧 乙 烯 (PEO-PPO-PEO)组成的三嵌段共聚物。具有无毒、无刺激、无免疫原 性、可溶于体液等优点，是制备聚合物胶束的常用材料之一。普朗尼 克内部的 PEO 链与 PPO 链的比例可调，随着 PEO 链比例增高，该化 合物疏水性越弱，反之，则疏水性越强。普朗尼克在水溶液中自发形 成多分子胶束，所形成的胶束尺寸和病毒相仿，适合在体内传输。 整合素是细胞表面受体的主要家族，是一种介导细胞和其外环境 之间的跨膜受体。整合素是由α和β两个亚单位形成的异二聚体，由 它们相互组合形成的整合素有 20 余种。其中，整合素αvβ3 高效表 达在多种肿瘤细胞表面和肿瘤新生血管的内皮细胞中，而在普通细 胞中罕有表达，因此，整合素αvβ3 已成为抗肿瘤药物的靶点。RGD 肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽链，能以一 定的亲和力结合整合素αvβ3，为肿瘤治疗的靶向性提供了新的策 略。细胞穿膜肽可以在不损坏细胞膜的情况下穿过细胞膜进入细胞 质甚至细胞核。同时，它还可以介导 DNA、多胺类物质进入细胞内。 TAT（transactivator, Tat）是编码 HIV 复制和基因表达所必须的 HYPERLINK /view/3852202.htm 反式激 HYPERLINK /view/3852202.htm 活蛋白，是常见的三种细胞穿膜肽之一。TAT 中 49-57 位氨基酸残基 arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg（RKKRRQRRR）组成的线性序列 可以完全行使细胞穿膜功能，这是 TAT 肽既有穿膜特性又无细胞 毒性的最小片段。大分子物质通过核孔复合物在细胞浆和细胞核之间 II 转运是一个主动耗能的过程，直径小于 9 nm 的分子或分子量小于 60 kDa 的蛋白质可被动弥散通过核孔复合物中间通道。非病毒载体转染 的质粒 DNA，从细胞质向细胞核被动转运时效率较低，是一个限速过 程。核定位信号肽 NLS 富含碱基，结合 DNA 形成的 DNA-NLS 复合 物，在细胞质中可被转运蛋白识别，与蛋白质结合后将 DNA 转运入核。 这一特点对复合物克服细胞核膜屏障、提高体内转染效率至关重要。 拟设计三种多肽：（1）特异性亲和整合素αvβ3 的 RGD（R4）；（2） 特异性亲和整合素αvβ3 的 RGD 肽与核定位信号肽 NLS 连接形成的 双功能肽 RGD-NLS（R11）；（3）特异性亲和整合素αvβ3 的 RGD 肽与细胞穿膜肽 TAT、核定位信号肽 NLS 连接形成的三功能肽 RGD-TAT-NLS（R18）。通过与 PEI 衍生物的连接，考察其作为基 因载体修饰物对