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市售鹿鞭DNA指纹鉴定研究 　　[摘要] 目的 探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征，建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法 对市售鹿鞭进行样本处理，模板制备，采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应，对市售鹿鞭样本采取DNA指纹鉴定。结果 对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定，有三个样本为正品。结论 此方法对市售鹿鞭鉴定，可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好，简便准确而可行，说明鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征，所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。 　　[关键词] 市售鹿鞭；线粒体DNA；DNA指纹鉴定 　　[中图分类号] R282.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）02-50-03 　　20世纪80年代，由于分子分类学的出现，使人们从研究生物形态表征进入到生物的DNA遗传物质。人们可以根据DNA系列的差异来鉴定生物物种，是因为同种生物体有相同的DNA系列，不同种生物有不同DNA系列。除了矿物类药材外大多数药材是从动植物中得到，动植物药材一般从死亡的干燥生物或者其组织器官中来。随着生物体的逐渐死亡，DNA会被核酸酶大量降解，使药材中DNA的分析有一定难度。近些年，分子生物学发展速度很快，尤其是微量DNA提取技术与PCR扩增技术，使从药材中提取分析微量的DNA成为可能，也为药材进行DNA技术鉴定提供了可能。DNA分析技术使中药材和与其容易混淆品种之间如何更好地鉴定找到了一个好办法。mtDNA是遗传信息的载体，它被认为是动物起源进化的研究和分析群体遗传的最佳对象，Cytb进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可以应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究 。本研究旨在探索将DNA指纹鉴定技术应用于市售鹿鞭鉴定中，以此提高其鉴定准确性[1]。 　　1 材料与仪器 　　1.1 一般材料 　　1.1.1 样本 市售的鹿鞭由吉林市参茸市场随机购买，共2批，抽取6个样本，编号为：1、2、3、4、5、6。干品牛鞭样本，编号为7。鹿鞭及其伪充药材均经吉林市食品药品检验所鉴定。 　　1.1.2 酶及DNA分子量标准 Taq酶：购自北京鼎国公司，λDNA/HindⅢ：购自TIANGEN公司，DNA MarkerⅠ：购自TIANGEN公司。 　　1.1.3 主要化学试剂 琼脂糖：购England，dNTP及PCR缓冲液：购自北京置鼎国公司，其他常用化学试剂：国产或进口分析纯。 　　1.2 主要仪器设备 　　TGL-16G台式高速离心机：上海医用分析仪器厂，H-2050R型台式低温高速离心机：美国Becman公司。 　　2 方法 　　2.1 样本的前处理 　　将市售鹿鞭中药材6个样本及干品牛鞭的龟头及阴茎部分，用粉碎机粉碎处理，将粉碎后的干燥纤维置于4℃保存，备用。 　　2.2 模板的制备 　　取粉碎后的市售鹿鞭6个样本及干品牛鞭1个样本各1.0g，彻底清洗后紫外照射30min，分别转入25mL离心管中，加入10倍左右的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），56℃保温72h。4000rpm 4℃离心15min，倒掉上清液。加入裂解液5mL，56℃水浴中保温过夜，至组织完全消化溶解。消化液用等体积饱和酚抽提1次，等体积酚-氯仿抽提2次，氯仿-异戊醇（24∶1）抽提1次。加入2倍体积的-20℃的无水乙醇，混匀放于冰箱中过夜。15000rpm 4℃离心30min，真空干燥，溶解于TE缓冲液。 　　2.3 聚合酶链式反应 　　以提取的市售鹿鞭和干品牛鞭mtDNA为模板，灭菌双蒸水作为阴性对照进行PCR。反应体系30μL，在0.5mL PCR反应管中依次加入10×PCR buffer 5μL，1.25mmol/L dNTP 4μL，10pmol/L引物1和引物2各2.0μL，Taq DNA聚合酶（1U）1μL，模板2μL，双蒸水补至30μL（总反应体系为30?L）。反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环后于72℃延伸5min[2]。 　　2.4 电泳鉴定 　　将PCR产物各取6?L，加2?L 6×loading Buffer，混匀后点样于2%琼脂糖凝胶中，DNA MarkerⅠ为参照，60V，30min，成像并拍照。 　　3 结果 　　4 讨论 　　线粒体DNA基因组的优点很多，比如分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、与核DNA基因组无共同序列、多拷贝、进化速率快、分子钟理论等，和核DNA相比更容易检测，亲缘关系相关或相近的物种都能得到区分和鉴定。采用mtDNA作为分子标记的研究工作已被广泛地展开，而且比同等长度的核DNA基因研究更为