应用超高分辨质谱成像技术研究脂类分子在小鼠肝组织中分布.docVIP

应用超高分辨质谱成像技术研究脂类分子在小鼠肝组织中分布 　　摘 要 利用基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪对磷脂类分子在小鼠肝组织中的分布进行了研究，建立了质谱成像技术检测小鼠肝组织中磷脂类分子分布的分析方法。以7 g/L ??α??-腈基-4-羟基肉桂酸的50%甲醇溶液（含0.2%三氟乙酸）作为基质，采用正离子采集模式，准确鉴定了5类13种磷脂类分子，其分子量主要分布在700～900 Da之间，且观察到它们在组织内分布呈现不均匀性。本研究表明，以超高分辨和超高精度的质谱仪开展组织成像研究， 不仅可以探究脂类分子在组织中的分布，而且可以直接准确鉴定相关分子，真正实现分子水平上的组织成像。 　　关键词 质谱成像；基质辅助激光解吸电离-傅里立叶变换离子回旋共振质谱法；肝组织；磷脂 　　 　　1 引 言 　　质谱成像技术[1]是以基质辅助激光解吸电离技术为基础开发出的一种新型组织内分子成像技术。该技术可以在分子水平上对生物组织内的分子“直接”分析，经过图像重建软件获得组织内分子的定位、定性和定量信息，其检测对象包括内源性小分子[2～4]、药物代谢产物[5～8]、多肽[9～11]和蛋白质[12～15]等。脂类分子是一大类重要的生命基础物质，是生物体质膜结构的重要组成部分，同时作为细胞信号分子参与生物体内的诸多生理活动。研究表明，脂类的异常代谢和分布与疾病相关，如胰岛素抗药性糖尿病、阿尔海默病、癌症和感染性疾病等[16]。本研究利用基质辅助激光解吸电离-傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（MALDI-FTICR MS） 研究了小鼠肝组织中的磷脂类分子的分布及其丰度变化，对分子进行了准确鉴定，真正实现了分子水平上的组织成像分析。2 实验部分 　　2.1 仪器、试剂与材料 　　9.4 T Apex-Ultra????TM Hybrid Qq-FTICR MS质谱仪（德国布鲁克公司）；Synergy UV超纯水系统（美国密理博公司）；CM 1900冷冻切片机（德国莱卡公司）；Image Prep基质覆盖仪（德国布鲁克公司）；真空冻干机（美国西盟公司）。 　　甲醇（色谱纯，美国飞世尔科技公司）；三氟乙酸（TFA，色谱纯，美国天地试剂公司）；标准品??Peptide calibration standard Ⅱ（德国布鲁克公司）；包被氧化铟锡（ITO）载玻片；??α??-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）。 　　6周龄c57小鼠（中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心）。 　　2.2 标准品及基质溶液的配制 　　0.5 SymbolmA@ mol/L标准品溶解于125 SymbolmA@ L 0.1% TFA溶液中，振荡混匀30 s，分装后置于－20 ℃保存。准确称取0.105 g CHCA基质两份，分别溶解于15 mL 50%甲醇和含0.2% TFA的50%甲醇溶液中。 　　2.3 实验方法 　　2.3.1 肝组织样本的制备 颈椎脱臼法处死小鼠后，立即择取肝组织，超纯水冲洗净肝组织表面血迹后直接置于50 mL离心管中。离心管底部接触液氮即开始气化沸腾，大约保持20 s组织迅速冰结成块后转移至于－80 ℃冰箱保存。 　　2.3.2 组织切片的制备 组织从－80 ℃冰箱转移至CM 1900冷冻切片机，冷冻切片机操作温度为??－20 ℃??。连续获取相邻两个厚度为7 　　SymbolmA@ m的肝组织切片，分别置于两个 ITO 载玻片上，然后置于真空干燥机中干燥10 min。利用Image Prep基质覆盖仪对两个肝组织切片分别喷洒25 mL 两种基质溶液。 　　2.3.3 质谱条件 正离子采集模式；扫描范围：m/z 100～1500；扫描步长：200 SymbolmA@ m；激光斑点：40 SymbolmA@ m；激光照射点数：50；每张质谱图累加4次；质量校准：用标准品Peptide mixture进行外标法校正，误差小于??2×10????－6????。Hystar 3.4和Apex Control 3.0质谱图采集软件, DataAnalysis 4.0质谱图分析软件, FlexImaging 2.1质谱成像软件由布鲁克公司提供。 　　2.3.4 数据处理 根据傅立叶变换离子回旋共振质谱仪的一级质谱图可以准确测定脂类分子的分子量。通过检索脂类分子数据库Lipid MAPS（/）鉴定肝组织中的脂类分子。其参数设定为：离子强度大于5000；质荷比容许误差：±0.005；离子种类：[M＋H]??＋， [M＋Na]??＋和[M＋K]??＋。 　　?┓? 析 化 学???┑?39卷?? 　　?┑?1期???┝? 辉等： 应用超高分辨质谱成像技术探究脂类分子在小鼠肝组织中的分布???? 　　3 结果与讨