蛋白表达及纯化-.ppt

蛋白表达、纯化 抗体制备应用及ELISA间接法 Part 1: 蛋白表达、纯化  Expression System Characteristics Vector 二 大肠杆菌表达载体的基本组成 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10% - 30%以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的, 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 常用的大肠杆菌表达载体启动子： λ噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子 筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。 X gene 引物的设计：设计一对特异性引物。上游、下游引物引入酶切位点 oligo6 RNA提取：TRNzol（附件） RT-PCR：附件 Gene cloning Protein expression 检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达，并确定在不同IPTG浓度和时间蛋白诱导效率的差异。 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。 37C，1mM IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD600＝0.4-0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。 诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600为0.4的菌加40ul buffer)加入2×上样缓冲液，混匀，-20℃保存或直接上样。 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS胶。（50KD蛋白10％或12％） 诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2×上样缓冲液，vortex。 将收集的菌液在水中煮5min，上样10μl ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。 取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。 IPTG induction Protein Purification Characterize function, activity, structure Use in assays Raise antibodies many other reasons ... Guidelines for protein purification Define objectives Define properties of target protein and critical contaminants Minimize the number of steps Use a different technique at each step Develop analytical assays Basic scheme of protein purification Protein preparation, extraction, clarification Protein isolation, concentration, and stabilization Fractional precipitation of proteins Intermediate Purification An introduction to liquid chromatography Protein solution applied to a column Column = solid porous matrix (stationary phase) + liquid (mobile phase) Proteins separated based on differing interactions with stationary and mobile phases Mobile phase conditions can be adjusted to increase or decrease affinity of protein for stationary phase (gradient) Size exclusion chromatography Affinity Chromatography Most c