川翠3号黄瓜SSR指纹图谱构建及种子纯度鉴定.docVIP

川翠3号黄瓜SSR指纹图谱构建及种子纯度鉴定 　　摘 要：为了建立杂交黄瓜品种川翠3号的快速纯度鉴定体系，用164对全基因组覆盖的SSR引物对川翠3号及其亲本进行了多态性筛选及纯度鉴定。其中4对引物表现出稳定的共显性，电泳图谱清晰、易分辨，特异性强，对川翠3号种子鉴定纯度为99.0%，真、假杂种编号与田间鉴定结果一致，可以用来区别其中混杂的母本、父本及其他种子，说明这4对引物组成的指纹图谱能为川翠3号杂交种的真伪鉴定、纯度检测及亲本提纯等提供准确的技术指导。 　　关键词：黄瓜；川翠3号；SSR指纹图谱；纯度鉴定 　　种子纯度鉴定是保证种子质量的关键环节。传统的种子形态学鉴定、幼苗鉴定法不适用于黄瓜种子纯度鉴定。田间小区种植鉴定法，周期长、费用高，无法满足种子贸易中快速鉴定的要求，且受环境影响大，结果不够准确。DNA电泳鉴定技术为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、高效的方法，可以弥补其他纯度鉴定技术中的许多缺陷，具有以下优点：在植物任何组织的任何发育时期均可用于分析；多态性位点分布广，遗传稳定；不受任何环境因素的影响。 　　SSR引物共显性的特点在杂交种纯度鉴定具有独特优势，已在水稻[1～4]、玉米[5]、棉花[6，7]、油菜[8，9]、茄子[10]、大白菜[11]、花椰菜[12]、黄瓜[13]等多种作物上应用。SSR的位点特异性和日益丰富的标记群体使SSR成为基因精细定位及作图的有力工具。目前黄瓜已开发的SSR标记已有2 000多对[14～16]，位点多，分布均匀，检测区域覆盖黄瓜7条染色体。利用SSR分子标记，黄瓜叶片苦味、矮化、果实网纹等重要基因都能够被定位，为克隆奠定了基础[16～18]。同时，SSR分子标记也是黄瓜种质资源多样性分析的重要方法之一[19，20]。总之， SSR标记具有共显性、位点特异性、位点丰富、稳定、易操作等特点，因此成为构建分子指纹图谱的重要标记。 　　随着品种保护的需求增加，加之亲本退化等问题严重，需要建立信息更丰富的骨干材料分子指纹图谱。川翠3号是高产优质华北型黄瓜新品种，对黄瓜霜霉病、白粉病等主要病害有较强抗性，具有较大的推广应用前景。本文利用SSR 分子标记技术，构建了川翠3号及其亲本的DNA指纹图谱，以期为该品种的权益保护、真伪鉴别、杂种纯度鉴定和亲本提纯等提供理论依据和技术指导。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　黄瓜品种川翠3号单株100株及其亲本各20株，由四川省农业科学院园艺研究所黄瓜课题组提供。供试材料于2013年7月中旬播种，7月23日定植于四川省农科院园艺所黄瓜课题组双流基地，露地常规栽培管理。小区种植F1植株350株，田间种植按随机区组设计，3次重复。随机选取100株挂牌标记编号，用于SSR分析和田间性状调查。 　　1.2 试验方法 　　①基因组DNA的提取 父本、母本各20株，幼嫩叶片等量混合后用CTAB法小量提取DNA。100株F1植株分单株取幼嫩叶片，分别提取DNA，且DNA试管标记号与植株田间挂牌号一致。在1%琼脂糖凝胶上检测DNA质量，并稀释到适当浓度，-20℃保存备用。 　　②PCR扩增和电泳检测 164对全基因组覆盖的SSR引物来自Ren等[14]、Miao等[15]公开发表信息，由上海生工生化公司合成。SSR反应体系，总 　　共25 μL，包括：20 ng模板DNA，前后引物各 　　1.0 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5 μL，1.0 U Taq酶， 　　0.2 mmol/L dNTPs。SSR扩增体系为：94℃预变性 　　5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30次循环；最后72℃延伸10 min。采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，180 V电泳2.5 h后检测PCR扩增产物，获得亲本和杂交种的扩增条带，银染显色后记录结果。SSR标记的数据记录根据电泳结果采用0、1系统描述条带的相对位置，条带清晰的记为1，缺失的则记为0，依据分子量从小到大的顺序读带，不具多态性的条带不予统计。 　　③田间纯度鉴定 9月中旬对100株标记单株进行田间纯度鉴定。田间纯度鉴定方法为主要差异表型性状比对，调查性状有：株型、株高、叶形、节间长度、瓜形、瓜色、果实表面蜡粉、瓜把、瓜长等。 　　2 结果与分析 　　2.1 杂交种共显性标记的筛选 　　用164对SSR引物对亲本DNA进行扩增，每对引物扩增的位点为1～2个，片段大小介于100～500 bp。扩增后电泳检测显示12对引物亲本间有多态性，多态性比例为7.31%。其中4对引物（ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385）在F1中呈共显性（表1），条带清晰，亲本特征片段分子量差异大于10 bp，分别位于