山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖侵袭和迁移影响.docVIP

山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖侵袭和迁移影响 　　【摘要】目的：研究山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）分别作用于胶质瘤U118细胞0h、24h、48h，分别采用CCK-8实验、划痕实验、Transwel1实验对细胞的增殖、迁移、侵袭能力进行检测。结果：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于胶质瘤U118细胞24小时和48小时均能显著降低细胞的增殖能力（P0.05），且当山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于U118细胞48小时，增殖抑制率分别高达20.64%、47.61%、51.23%；划痕实验结果表明，不同浓度山慈菇水煎剂作用24小时及48小时均能明显降低胶质瘤U118细胞的迁移能力（P0.05），且48小时药物降低细胞迁移的能力高于24小时；体外侵袭实验显示，山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）培养24h和48h均能明显的降低侵袭细胞数目，差异具有统计学意义（P0.05）；结论：山慈菇水煎剂能够减轻U118胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，但对于其具体的机制还需要进一步的研究。 　　【关键词】山慈菇水煎剂；胶质瘤细胞；增殖；侵袭；迁移 　　胶质瘤是一种发病率高、致死率高的恶性脑肿瘤，5年内脑胶质瘤患者的生存率小于10%，该病多发于30岁至40岁的中年人群，其约占中年颅内肿瘤患者的1/3至2/3。胶质瘤侵袭性高，发病机制复杂，对于该疾病还没有完全根治的治疗方法[1]。目前，对于脑胶质瘤的治疗，临床上主要采用手术配合术后放化疗为主。放化疗不仅对肿瘤细胞存在杀伤力，对机体内正常的细胞也有很强的杀伤力[2]，副作用强，加重患者的不良反应，严重影响患者的生存质量及生活质量[3-5]。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，有解毒消肿的功效，用于痈疽恶疮、淋巴结核和蛇虫咬伤的作用。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭与转移、抗炎等作用。本课题采用山慈菇水煎剂作用于胶质瘤细胞，研究其对该细胞增殖、侵袭和迁移的影响，以期为脑胶质瘤靶向治疗药物的研究提供参考和依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 药物及制备 　　U118胶质瘤细胞株由上海复旦大学细胞库提供，山慈菇购自北京同仁堂药店。电子精密天平秤取100g山慈菇?材，根据传统中药煎煮方法进行煎煮。待液体至100mL附近时将其转移至高压灭菌后的烧杯中，并使用无菌培养皿将盛有煎剂的烧杯盖住，浓缩煎剂至50mL。于超净工作台中将水煎剂加入离心管（经高压灭菌处理）中，离心5min，转速为1000r.min-1，取上清。取5μL上清加入1mL无菌DMEM培养基中，置于3712，5%c02培养箱中放置48h，观察水煎剂是否染菌。剩余上清密封于4℃保存备用。48h培养后的上清置于显微镜下观察，确认无菌后，此次制备的水煎剂上清（2kg?L-1）原液即可用于后续的实验中。根据实验所需要的水煎剂浓度加入培养基，在超净台中，无菌条件下，稀释至研究所需要的浓度。 　　1.2 仪器与试剂 　　CCK-8试剂、碘化丙啶（PI）试剂、DMSO试剂、DAPI试剂、RNA酶、生理盐水和无水乙醇购于Sigma公司；胰蛋白酶购于Hyclone公司；胎牛血清（FetalBovine Serum，FBS）、DMEM高糖培养基购于美国Gibco公司；Transwell小室购于美国Coming公司；Matrigel基底膜购于美国BD公司；多功能酶标仪购于美国Mo-lecular Devices公司；倒置显微镜购于日本OLYMPUS公司，CO2培养箱购于德国BINDER公司；细胞培养箱购于美国Forma Scientific公司。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 人胶质瘤细胞培养 　　人胶质瘤U118细胞采用含10%FBS（已灭活）的高糖DIVIEM培养基培养细胞，将细胞置于3712、5%C02培养箱中培养，依据细胞具体生长状况，带其长满培养瓶70%～80%时对其进行传代处理，周期约为2天到3天，取对数生长期的细胞用于后续实验研究。 　　1.3.2 CCK-8实验 　　细胞增殖情况采用CCK-8方法进行检测。取对数生长期U118细胞，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，置于3712、5%CO2培养箱中过夜，待其贴壁后加入山慈菇水煎剂（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培养24h：另外同样分组，山慈菇水煎剂（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）作用于细胞48h。待药物作用时间足够，弃去细胞培养液，PBS洗两遍，吸净PBS洗涤液，加入10μL CCK-8试剂，在细胞培养箱中孵育4h，450nm波长处酶标仪测定各孔光吸收值（OD