巴戟天―牛膝醇提物对SD大鼠软骨细胞G1S周期蛋白与基因表达影响实验研究.docVIP

巴戟天―牛膝醇提物对SD大鼠软骨细胞G1S周期蛋白与基因表达影响实验研究 　　【摘 要】目的：探究巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培养的SD大鼠软骨细胞G1/S周期蛋白与mRNA含量表达的影响，为其防治骨关节炎的临床应用提供依据。方法：①用乙醇加热回流法获得其醇提物成分；采用机械-酶消化法分离SD大鼠膝关节处的关节软骨，建立体外培养细胞模型并进行鉴定；②MTT法检测M-AAE对软骨细胞增殖特性的影响，使用倒置相差显微镜镜下观察软骨细胞状态；③PCR、Western blot法分别检测体外培养大鼠软骨细胞经M-AAE的0，75，150，300 μg?mL-1 DMEM溶液干预48 h后的mRNA、蛋白含量的表达。结果：①软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色；②经MTT检测M-AAE对软骨细胞增殖具有一定的时效-量效关系，其最佳干预时间和浓度分别为48 h和150 μg?mL-1；③M-AAE干预软骨细胞后，各加药组细胞周期蛋白依赖性激酶-4（CDK4）、细胞周期蛋白D1 （Cyclin D1）的mRNA与蛋白含量的表达量均明显高于0 μg?mL-1组，其中以150 μg?mL-1组的表达量最高（P 0.05）。结论：M-AEE可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达，对SD大鼠软骨细胞具有一定的促增殖作用。 　　【关键词】 骨关节炎；巴戟天；牛膝；醇提物；软骨细胞；增殖；大鼠 　　骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种临床常见的骨科退行性疾病，由于生物力学作用异常等叠加因素的影响，引起关节软骨代谢及修复功能失衡，进而加剧关节软骨退变，造成关节损害。临床表现常以关节反复性疼痛、肿胀、活动障碍为主。鉴于其发病周期长、致残率高等特点，对其防治具有重要现实意义[1-2]。目前，治疗OA的方法众多，大致可分保守治疗和手术治疗两大类。其中，保守治疗以药物为主，西医主要有口服和局部给药两种方式，前者因非甾体抗炎药等产生的胃肠道不良反应而使用受限，而后者可有感染危险且效果也非常有限；手术方法作为一种补救措施，因其并发症较多，影响因素复杂，且术后需要长时间康复，远期疗效有待进一步考证。中医药疗法治疗具有多靶点、疗效显著、副作用小、适合长期治疗等优势[3]。 　　当前，在中医药领域，补肝肾祛风湿法在防治OA上应用广泛，并成为该领域研究热点[4]。巴戟天、牛膝均具有补肝肾、祛风湿、强筋骨功效，是临床治疗OA常用配伍药。巴戟天、牛膝的联用可追溯到《备急千金要方》记载的巴戟天酒，其合用可增强补肾强筋、祛风除痹之效用，治疗肝肾亏虚型骨痹具有良性作用；另外源自《太平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝组方。因此，本研究旨在观察药对巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培养大鼠软骨细胞周期蛋白与基因的影响，进而为其阐明防治OA的治疗机制及临床运用提供实验支持。 　　1 实验材料 　　1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠16只，体质量90～100 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK2012-0001（闽）。 　　1.2 实验药物 中药材巴戟天和牛膝，均由福州回春中药饮片有限公司提供。 　　1.3 主要试剂 磷酸盐缓冲液（HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技术有限公司）；RT-PCR引物合成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；TRIZOL（美国life）；异丙醇（国药集团药业股份有限公司）；无水乙醇（国药集团药业股份有限公司）；琼脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；WB玻板（美国BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制剂）；RISF（裂解液）、蛋白上样缓冲液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效显影液（Thermo）；质量分数为30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸钠）、10×电泳液、AP（过硫酸铵）、TEMED、50×TAE（碧云天生物技术研究所）；10×TBST（Solarbio）；高效封闭液（北京康为世纪生物科技有限公司）；一抗（兔抗）、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody（C-22，美国Santa Cruz Biotechnology）；二抗（羊抗兔，美国CST）等。 　　1.4 主要仪器 DNA扩增仪（9600型，美国PE）；低温高速离心机（64R型，美国BECKMAN）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；超纯水装置（MILLI-Q型，美国MILIPORE）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，