当归多糖对小鼠衰老造血干细胞端粒端粒酶及P53影响.docVIP

当归多糖对小鼠衰老造血干细胞端粒端粒酶及P53影响 　　[摘要] 目的：观察当归多糖（ASP）对小鼠造血干细胞（HSC）端粒长度、端粒酶活性及P53表达的影响，探讨ASP调控HSC衰老的可能机制。 　　方法：C57BL/6J小鼠随机分为正常组、衰老组和干预组，衰老组采用X线全身均匀照射，建立小鼠HSC衰老模型；干预组在照射期间给予ASP灌胃；正常组给予NS灌胃。免疫磁珠分离HSC，运用细胞周期分析和β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察HSC衰老生物学变化； Western blot检测P53蛋白表达，Southern blot 和TRAP-PCR分别检测HSC端粒长度和端粒酶活性。 　　结果：与正常组比较，X线能显著增加衰老组HSC G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率及P53蛋白表达；降低端粒长度和端粒酶活性。与衰老组比较，ASP能显著抑制衰老HSC G1期细胞比例及SA-β-Gal染色阳性细胞率的增加；下调P53蛋白表达；增加端粒长度和端粒酶活性。 　　结论：ASP能够拮抗X线诱导的HSC衰老，其作用机制可能与增加端粒长度及端粒酶活性、下调P53蛋白表达有关。 　　[关键词]当归多糖；造血干细胞；细胞衰老；端粒 　　细胞衰老是生物体衰老的基本单位、人类老年病发病的共同基础。端粒、端粒酶和细胞衰老的关系越来越受到重视，成为目前关于细胞衰老分子机制的主流假说之一。研究表明，先天性角化不良、特发性肺纤维化和再生障碍性贫血患者体内的端粒酶可发生突变，其端粒也会慢慢丢失，最终导致寿命缩短[1-2]。当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）是从当归中分离、提取的药用有效成分，具有促进造血、抗肿瘤、抗辐射损伤和免疫调节等作用[3-6]。目前，有关ASP能否拮抗造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）衰老及其作用机制尚不清楚。本研究通过X线照射建立小鼠HSC衰老模型，观察ASP对HSC端粒长度、端粒酶活性及P53蛋白表达的影响，探讨ASP调控HSC衰老的可能机制，为预防及开发老年性疾病药物提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物和试剂 6～8周龄健康清洁级C57BL/6J小鼠，体重16～20 g，雌雄各半，由重庆医科大学动物中心提供，合格证号SCXK（渝）2007-0001。当归多糖（ASP）购自陕西慈缘生物技术有限公司，纯度≥95%；淋巴细胞分离液购自Axis-Shield公司；Anti-Sca-1 MicroBead Kit购自Miltenyi公司；SA-β-Gal Staining Kit购自Cell Signaling公司；P53兔抗鼠多克隆抗体购自Bioworld Technology公司；细胞蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒及化学发光增强剂均购自Pierce公司；PVDF膜购自Millipore公司；抗GAPDH小鼠单克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体购自Jackson公司。端粒酶活性检测试剂盒购自KeyGEN公司，端粒探针：biotin- 5′-CCCTAACCCTAACCCTAA-3′购自Invitrogen 公司。 　　1.2 动物分组及模型建立 72只C57BL/6J小鼠随机均分为正常组、衰老组和干预组，干预组和衰老组采用X线3.0 Gy全身均匀照射（照射能量6 MeV，照射时间1 min，照射面积为25 cm×25 cm，照射源距动物的高度为100 cm），每10 d 1次，共8次，总计24 Gy（3.0 Gy/8F），并于照射当日分别给予ASP 200 mg·kg-1和等容量NS灌胃，隔天1次，共40次[7-8]。正常组给予等容量NS灌胃。末次照射后第10天处死动物。 　　1.3 HSC分离与纯化 脱颈处死小鼠，在无菌条件下取出股骨及胫骨，用1640培养液冲出骨髓，制备单细胞悬液，加淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞。采用造血干细胞最常见标志物干细胞抗原（Sca-1）鉴定及分选HSC，流式细胞仪检测Sca-1+细胞比例即为HSC的纯度[9]。 　　1.4 流式细胞仪分析G1期细胞比例 各组收集1×105 个HSC，PBS洗涤，70% 冰乙醇固定过夜。离心弃上清，PBS洗涤，加100 μL牛胰核糖核酸酶，37 ℃孵育30 min。碘化丙啶（50 mg·L-1）避光反应30 min，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析。 　　1.5 SA-β-Gal 染色检测衰老细胞 取1×105 个HSC，PBS洗涤2次，加固定液1 mL充分混匀，固定10 min，PBS洗涤2次，加入含solution A，solution B 与staining solution三者的工作液1