当归多糖联合阿糖胞苷诱导人白血病KG1α细胞株衰老实验研究.docVIP

当归多糖联合阿糖胞苷诱导人白血病KG1α细胞株衰老实验研究 　　[摘要] 作者实验室最新研究发现，当归多糖（Angelica sinensis polysaccharides，ASP）对延缓造血干细胞衰老有明确的调控作用。白血病是一种造血干细胞水平的恶性血液肿瘤，ASP对白血病细胞有无调控衰老的作用却未见相关报道。该研究以对数生长期人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia， AML）细胞株KG1α为研究对象，将其分为当归多糖组（ASP组），阿糖胞苷组（Ara-C组），当归多糖与阿糖胞苷联合组（ASP+Ara-C组）和对照组，分别加入不同浓度的ASP，Ara-C和ASP+Ara-C，作用不同时间，旨在研究当归多糖联合阿糖胞苷诱导人白血病细胞株KG1α衰老的作用及其相关机制。结果显示，ASP，Ara-C，ASP+Ara-C在体外能明显抑制KG1α细胞增殖，使细胞阻滞于G0/G1期；细胞呈现衰老形态学特点；衰老染色阳性细胞率显著增高；并能显著上调衰老相关蛋白P16与RB的表达， ASP+Ara-C组的上述指标更加显著。综上所述， ASP与Ara-C诱导KG1α细胞衰老的机制可能与调控衰老相关蛋白的表达有关，提示ASP与抗肿瘤药物联合用药在白血病治疗中可起到更好作用。 　　[关键词] 当归多糖；白血病；KG1α细胞；衰老 　　当归多糖（Angelica sinensis polysaccharides， ASP）是祖国医学“补血”要药当归的重要药效成分。本课题组既往工作和其他学者的工作证明，ASP对机体的免疫系统和造血系统有明显的促进作用，抗肿瘤和抗辐射损伤也显示良好的功效[1-4]。传统中医理论认为某些中药及其有效成分有“双向调控”作用，即对正常组织细胞和异常组织细胞的作用存在差异。本课题组最近研究发现，ASP对延缓造血干细胞衰老有明确的调控作用[5-6]。白血病是造血干细胞水平的恶性血液系统肿瘤，ASP是否对白血病细胞有诱导衰老的作用是值得探讨的科学问题。本研究以人急性髓系白血病KG1α细胞株为研究对象，研究ASP与Ara-C诱导人白血病细胞株衰老的作用及其相关机制，旨在为探讨天然药物有效成分调控肿瘤细胞衰老提供实验依据，为白血病等肿瘤的治疗提供新的思路和方法。 　　1材料与方法 　　1.1细胞株 KG1α细胞株由重庆医科大学临床检验医学院惠赠，在含10%胎牛血清的1640培养体系、37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d换液传代1次。 　　1.2药品、试剂与配制 ASP购自陕西慈缘生物技术有限公司（批号CY130421，甘肃岷县当归提取，纯度≥95%），1640培养液配制成所需浓度；Ara-C购自国药一心制药有限公司（国药准字相对分子质量279.68），1640培养液配制成所需浓度。RPMI-1640培养基（Hyclon公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8（上海七海复泰生物科技有限公司）；Wright′s染液（本实验室配制）；衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）；P16兔多克隆抗体（安博生物技术有限公司），β-actin鼠多克隆抗体、RB兔多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体、山羊抗兔抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 　　1.3细胞分组与增殖抑制率检测 取对数生长期的KG1α细胞分为：ASP组，培养体系中加入0.5～3 g·L-1的ASP；Ara-C组，培养体系中加入0.05～0.25 g·L-1的Ara-C； ASP+Ara-C组，同时加入1～2 g·L-1的ASP和0.08～0.16 g·L-1的Ara-C；对照组，加入等量的培养液。调整细胞密度为5×107个/L，以每孔200 μL的培养体系接种于96孔板，每个浓度分设3个复孔，同时设立无细胞的空白对照组。各组置37 ℃，含5%CO2的孵箱中培养24，48，72 h，加入20 μL的CCK-8继续培养4 h，酶联免疫检测仪测定各孔A450，细胞增殖抑制率=（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白对照组）×100%。 　　1.4流式细胞术分析细胞周期各时相分布 分别收集培养48 h的对照组（常规培养）、ASP组（终浓度2 g·L-1）、Ara-C组（终浓度0.16 g·L-1）、ASP+Ara-C组（ASP 2 g·L-1+Ara-C 0.16 g·L-1）KG1α细胞1×105个，PBS洗涤2次，用70%冷乙醇4 ℃固定过夜。测定前将固定液遗弃，加入碘化丙啶和RNA酶工作液，在4 ℃染色处理30 min，用300目滤网过滤后上流式细胞仪，经计算机数据处理，分析得出细胞周期的各时相比例。 　　1