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快速PCR介导NeuroD―3′UTR定点突变研究 　　摘要：糖尿病是一种由遗传和环境因素共同引起的代谢紊乱综合征。与肝细胞核因子有关的幼年发病的成人型糖尿病（MODY） 属于特殊类型的糖尿病，分为6型，其中Ⅵ 型MODY 为bHLH 家族转录因子NeuroD 突变引起的疾病。在体内NeuroD能够与A类bHLH的转录因子E47结合，进而形成二聚体。这种二聚体能够与胰岛素基因的E盒高亲和力结合，从而激活胰岛素相关基因的转录表达；因此，NeuroD对胰腺β细胞的生理功能有很重要的影响。本试验利用PGMT-NeuroD-3′UTR质粒，通过一次PCR方法使NeuroD-3′UTR上的多个位点发生定点突变，并筛选出突变的目的片段；随后将突变的片断连接到萤光素酶报告载体PGL3-CONTROL上，构建了PGL3-3′NeuroD突变载体。该结果可为探讨NeuroD基因在胰腺β细胞发育中的生理功能，及进一步治疗糖尿病的研究提供了试验基础。 　　关键词：NeuroD；PCR；突变；载体构建；糖尿病 　　中图分类号： Q754 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0087-03 　　糖尿病（diabetes mellitus）是一种代谢性疾病，其特征为由于胰岛素分泌不足、胰岛素功能障碍或两者同时存在而导致的，以慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1]。糖尿病是一种由多种因素导致的疾病，这些因素包括遗传因素、自身因素（自身免疫）及环境因素[2]等。 　　神经分化因子1 （NeuroD-1） 是一种bHL H蛋白[3] 。在生物学中，NeuroD-1又称为β细胞E盒转录激活因子2 （Beta-2） 。NeuroD-1/Beta-2对靶基因的转录激活/抑制作用主要通过和靶基因中的特异性序列结合来实现的。同时，NeuroD-1/Beta-2也能够与其他靶基因的转录因子发生作用，协同调节靶基因的活性状态，进而影响相关基因的生理功能。随着生物学的不断发展，相关研究表明NeuroD-1/Beta-2基因发生突变时，对糖尿病的发生有一定的影响[4]。在利用模式生物小鼠研究NeuroD-1/Beta-2的生物学功能时发现，当NeuroD-1/Beta-2 基因缺失时，小鼠发生严重的糖尿病，并且这些患有严重糖尿病的小鼠在围产期发生死亡。在NeuroD-1/Beta-2基因纯合缺失的小鼠中表现的酮尿证实，这种严重的糖尿病是由于β细胞功能发生异常导致的[5]。因此，NeuroD-1/Beta-2 基因对研究胰腺发育和糖尿病机制具有重要的意义。 　　基因突变技术常用于研究基因调控、表达和蛋白质的结构功能等，其中，定点突变技术已经越来越被生物学家广泛应用于基因工程、蛋白质工程研究。目前使用较广泛的主要有重组PCR法、重叠延伸法、U模版法和大引物突变法等。其中，重叠延伸的方法和大引物突变的方法均需要多次PCR和多对引物，才能使得目标突变率高，这种方法操作复杂并且步骤繁琐。快速PCR介导的定点突变方法仅需1次PCR 反应，目标突变效率高，操作简单，节约成本[6]。 　　本试验为了构建NeuroD-3′UTR的定点突变，进一步研究NeuroD基因与糖尿病之间的生物学机制，采用快速PCR定点突变的方法，对NeuroD-3′UTR同时进行多个位点的突变，并筛选出突变的目的片段，构建了PGL3-3′NeuroD 突变载体，为探讨NeuroD基因在胰腺β细胞发育中的生理功能，及进一步治疗糖尿病的研究提供试验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　PGMT-NeuroD和PGL3-CONTROL载体由笔者所在实验室保存。 　　JM109感受态细胞，D2000 Plus DNA ladder购自北京索莱宝科技有限公司；1 kb DNA Ladder Marker购自于北京艾德莱生物技术有限公司；限制性内切酶XbaⅠ与FseⅠ（NEB公司），T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；DNA凝胶回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒均购自Omega公司；琼脂糖购自Biowest公司，其余试剂为国产分析纯试剂；PCR引物、质粒测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 突变引物设计与合成 根据NeuroD的编码序列（GenBank序列号：gi：226493587）（粗体为突变位点）设计上游引物P1，序列为：5′-GAAAAAAAACCAACAAATTCGTCAATTTGAGCAATTCATCT-3′，下游引物P2，序列为：5′-AGATGAATTGCTCAAATTGACGAATTTGTTGGTTTTTTTTC-3′。 　　1.2.2 快速PCR介导的突变 以PGMT-