应用基因芯片检测禽常见病毒的研究探究.docVIP

应用基因芯片检测禽常见病毒的研究* 吴时友 尹燕博 郑彤彤 韩丽敏 田振宇 张巧燕 毛雪松 山东澳兰生物工程研究院 青岛市 山东省 266101 摘要：利用RT-PCR或PCR技术扩增出新城疫病毒（Newcastle disease virus）、禽流感病毒（Avian Influenza）、传染性支气管炎（Infectious bronchitis virus）、、鸡马立克氏病(Marek’s Disease )、传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis）和鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal Disease )的各一段保守序列，通过微量点样技术这些探针点在硝酸纤维素膜上，从而产生二维DNA探针阵列，即基因芯片（gene chip）。由病料中提取核酸，通过RT-PCR或PCR和标记技术，将获得的PCR产物和基因芯片进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速，并行和高效的检测及分析。 近年来，在养禽业的迅猛发展的同时，禽的病毒性疾病变得更加复杂，混合感染,交叉感染已成为目前疾病的显著特征。集约化养殖的发展要求快速，及时，准确的对疾病作出诊断，但目前的一些方法，如病毒分离、血凝（HA）、血凝抑制（HI）、琼脂扩散、ELISA等费时费力，且一次只可检测一种病原，不能够满足其要求。我们所研制的病毒病基因芯片(gene chip)具有以上方法不可比拟的优越性。 基因芯片(gene chip)是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高薪技术，它主要是通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对DNA序列的准确、快速、大量信息的检测。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列能在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获得样品中的生物信息，其效率是传统的检测手段的成百上千倍，它是继大规模集成电路之后又一具有深远意义的科学技术革命。基因芯片技术应用于病毒性疾病可灵敏，特异，快速的检测病原，并且一次可检测多种病原,将有助于及时，快速，准确的发现病毒性疾病，避免病毒性病毒对养殖业造成的巨大损失，为养殖业的集约化发展创造有利的条件。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 Taq DNA聚合酶购自上海生工，PCR产物纯化试剂盒购自v－gene生物科技有限公司， M-MLV、dNTP购自Promega公司，RNAsin 购自大连宝生物工程有限公司,鲑鱼精 DNA，购自Sigama 公司，裂解液，由本研究院配制。 1.1.2毒株 NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV均购自中监所。 1.1.3仪器和设备 仪器和设备：PCR仪；点样器；杂交仪；扫描仪均为自行设计，委托生产厂家制造。 .2. 引物设计 作者:吴时友(1941-),男,研究员,主要从事生物技术在动物疫病诊断中的应用研究。 *专利号0 通过gene bank 分别查找到NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV各数条序列，然后使用DNAStar分析每一种病毒的高度保守序列，设计出针对这些病毒的引物。引物见表1。 1.3 基因芯片的制作 1.3.1种毒核酸的提取 各取细胞培养液400ul于1500ul离心管中,加裂解液600ul,稍振荡，加入氯仿450ul,振荡均匀后-20℃静置10min。12000r/min离心10min,取上清于新的离心管中，加异丙醇800ul, -20℃静置1h。12000r/minl离心10min,去上清，沉淀用冷乙醇洗涤，置超净工作台吹干。若病毒基因组是DNA可直接进行PCR，若是RNA则要进行RT。 1.3.2 核酸探针的扩增 以1.3.1所获得的核酸为模板，使用1.2所设计的引物，分别扩增出NDV、AIV、IBV、MD、ILT、IBDV的目的片断，以作为探针。PCR的反应条件如下 反应体系： 水 17ul 5 ×buffer 4 ul Mgcl(25m M) 4 ul dNTP（各2.5mM） 2.5 ul Taq (4U) 0.5 ul P1+P2 (50Pmol/ul) 0.5+0.5 ul 模板 2 ul 注： 稍离心（4000r/min） 循环参数 94.5℃ (预变性) 2min 94.5℃ (变性)