当归超临界提取物对AOMDSS诱导小鼠炎症相关性结直肠癌化学预防作用.docVIP

当归超临界提取物对AOMDSS诱导小鼠炎症相关性结直肠癌化学预防作用 　　[摘要] 采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）诱导的雄性小鼠结肠癌模型，研究当归超临界提取物对诱发小鼠结肠癌的化学预防作用，并探讨其可能的作用机制。给予雄性Balb/c小鼠单剂量皮下注射AOM（10 mg·kg-1），1周以后，给予2%DSS饮用7 d，诱导结直肠癌。分别按照15，30，60 mg·kg-1灌胃给予药物组当归超临界提取物至第17周。当归超临界提取物组肿瘤发生率、小鼠的荷瘤数及荷瘤体积均低于AOM/DSS模型对照组。这可能与当归超临界提取物能够显著降低AOM/DSS诱导的小鼠炎症相关结直肠癌模型中PCNA，COX-2，iNOS的表达有关。研究结果表明，当归超临界提取物对AOM/DSS诱导的小鼠炎症相关性结直肠癌的发生、发展有一定的干预作用，可进一步用于人类结直肠癌的化学预防研究。 　　[关键词] 当归超临界提取物；结直肠癌；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸钠 　　当归为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，味甘平，性温，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。其脂溶性成分挥发油主要含藁本内酯、丁烯基苯酞等成分。当归挥发油在当归化学总成分比例仅为0.62%[1]左右，却具有丰富的化学成分和广泛的药理作用。目前，国家药品标准的成方制剂中以当归挥发油入药的品种多达40余种。近年来研究发现，当归挥发油具有抗炎镇痛、提高机体免疫功能，可以用于肿瘤的辅助治疗[2]。本课题组前期研究发现，当归超临界提取物（SFE-AS）能够通过增加Nrf2/ARE通路中Nrf2的表达以及其下游的抗氧化酶和解毒酶的表达，增加细胞抗氧化、抗炎作用，其可能具有一定的癌症化学预防作用。本实验在前期研究的基础上，采用氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS） 诱发的结肠炎相关性癌症（colitis associated cancer，CAC） 动物模型，考察当归超临界提取物对炎症相关性结肠癌的化学预防作用，并测定小鼠结直肠黏膜中PCNA，COX-2，iNOS蛋白的表达。 　　1材料 　　1.1试剂及药材 氧化偶氮甲烷（AOM）购自美国Sigma公司；葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子质量36 000～50 000）购自美国MP公司；PCNA Mouse mAb，COX-2 Rabbit mAb购自美国Cell Signaling Technology公司；NOS2（C-19） Rabbit mAb购自Santa Cruz公司；甘肃岷县当归（产品编号121101），购自安国路路通中药饮片有限公司，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为伞形科植物当归A. sinensis的干燥根。按照本课题组制备当归超临界提取物的工艺[3]，制备得当归超临界提取物，出油率为（1.41±0.06）%，其中主要成分藁本内酯的质量分数为（42.12±0.75）%。 　　1.2动物 SPF级Balb/c雄性小鼠购自斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，动物合格证号SCXK（京）2011-0004。6周龄，体重18～22 g，饲养于北京中医药大学动物实验中心，高脂颗粒饲料喂养，自由饮水。正常饲养1周，以适应环境，自第2周开始实验。饲养室保持良好通风，控制环境温度（23±2） ℃，湿度（50±10）%，12 h循环光照。 　　2方法 　　2.1分组及模型的建立 将40只Balb/c雄性小鼠，在实验开始时，按体重随机分为5组，每组8只，分别为AOM+DSS模型对照组、当归超临界提取物低、中、高剂量组（15，30，60 mg·kg-1）、空白对照组。前4组腹腔注射AOM 10 mg·kg-11次，空白对照组腹腔注射等量的0.9%的NaCl水溶液，1周后给予前4组2%DSS水溶液自由饮用7 d；从第3周开始，药物组分别按15，30，60 mg·kg-1每天灌胃给予当归超临界提取物溶液，对照组和模型组平行灌胃给予0.1%的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）水溶液，直至第17周。 　　2.2观察指标和处理方法 实验过程中观察并记录小鼠的营养状况、活动状况、毛发、食欲、大便性状等，每周称量并记录其体重。至实验第17周结束实验，将小鼠禁食24 h之后，眼眶取血，静置取上清，之后颈椎脱臼处死，剪开小鼠腹腔，自盲肠末端将结直肠与小肠分离，直至肛门处，取下整段结直肠，并沿肠管纵轴纵向剖开，用预冷的中性PBS溶液清洗肠内容物。将冲洗干净的肠管黏膜面朝上平铺于大平皿内，仔细观察记录无肿瘤发生以及发生数目、大小和位置，计算肿瘤发生率。滤纸吸干结直肠上的PBS溶液，取结肠组织约1 cm置于1