微量生物样品中糖蛋白N糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法建立.docVIP

微量生物样品中糖蛋白N糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法建立 　　摘要 基于电喷雾电离质谱检测技术，建立了一种可靠、高效、简单，适合于微量糖蛋白N糖链解离、富集纯化的方法。以糖蛋白牛胰核糖核酸酶（Rib B）和卵清白蛋白（OVA）为模型蛋白直接酶解，比较了4种方法纯化酶解样品的效果。比较了直接酶解和经过聚偏氟乙烯（PVDF）膜富集后酶解微量复杂生物来源样品胎牛血清的酶解效果，最终建立了微量生物样品中糖蛋白N糖链的质谱分析前处理方法。采用PVDF膜吸附复杂生物样品中的糖蛋白，N糖苷酶F（PNGase F）酶直接在膜上完成糖链释放（37℃，24 h），采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化，用于微克级胎牛血清和健康人血清中N糖链质谱分析的前处理。本方法通用性好，在微量生物样品糖链质谱分析检测的前处理方面具有一定应用价值。 　　关键词 微量分析； 糖蛋白； N糖链； 电喷雾质谱； 前处理 　　1引言 　　蛋白质糖基化是真核细胞中最常见的翻译后修饰，对蛋白质生物学功能的发挥起着至关重要的作用。糖蛋白上的糖链具有高度的微不均一性，在癌症、衰老等不同的病理生理条件下会发生变化[1]。以糖链作为研究对象，筛选癌症血清标志物，可以为癌症的早期诊断、预后、治疗反应预测和群体筛查开辟新的途径[2]。 　　血清中糖蛋白的特点是微量、成分复杂、糖链含量更少。质谱技术具有微量、快速、准确和高通量的优点，能满足对微量糖链的分析，为研究生物来源样品提供了强有力的手段[3]。但质谱技术对复杂生物样品的前处理要求高，样品中的杂质会影响糖链的质谱分析。血清成分十分复杂，含有大量蛋白质，以及很多小分子物质如盐类、脂类和游离糖等[4]，给糖组研究带来困难。聚偏氟乙烯（PVDF）膜由于带有负电荷，可与蛋白质中的带正电氨基酸吸附结合，已广泛应用于蛋白的吸附和转移[5]。在PVDF膜上采用最常用的N糖苷酶F（PNGase F）[6]酶解法释放N糖链，解离后的糖链常与蛋白质变性剂、缓冲剂以及肽段等杂质混在一起，导致糖链的信号被严重抑制。另外，高丰度糖链还会掩盖低丰度糖链，降低了样品中全部糖链被鉴定的几率。因此在糖链的质谱分析中，对解离后的样品进行纯化和富集至关重要。常用的方法有石墨碳柱、C18柱、阳离子交换树脂、BioGel P4或Sephadex G10等，但这些方法的纯化效果不稳定，应用时有一定的局限性。BioGel P4和Sephadex G10均属于凝胶排阻色谱，填料前处理步骤复杂，纯化效率缓慢，不适于高通量纯化游离糖链。离子交换树脂对糖链无保留，通过H+和盐类阳离子的交换达到除盐的目的，但可能会造成带电荷糖链的丢失。C18柱能够吸附水溶液中的疏水性物质，比如蛋白质，但对亲水物质例如糖链只有很弱的亲和力，因此C18柱常被用于分离蛋白质与糖链。石墨碳柱基于填充剂与样品的疏水相互作用，以及电子受体供体之间的相互作用，不但可以快速分离糖链和蛋白质，还能除去盐类、去垢剂等。微晶纤维素柱能够吸附极性较大的物质，但对疏水性的物质吸附能力弱，因此被用于糖链与疏水性杂质的分离纯化[7～9]。但在实际样品分析时，单一使用一种方法得到的样品往往无法满足质谱分析的要求，经常由于杂质的干扰而造成质谱信号丢失。因此需要联合使用这些方法，实现糖链的有效富集和纯化。 　　本研究以糖蛋白牛胰核糖核酸酶（Rib B）和卵清白蛋白（OVA）为模型蛋白，采用PVDF膜吸附糖蛋白， PNGase F直接在膜上完成糖链释放。比较了常用色谱柱联合使用对糖链的纯化效果，最终确定采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化，进行电喷雾质谱检测前的样品制备。将本方法应用于微克级微量复杂生物样品如人和胎牛血清中N糖链质谱分析的前处理，效果良好。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　LTQXL电喷雾电离质谱仪（ESI，美国Thermo Finnigan公司）。鸡卵清白蛋白（OVA）、微晶纤维素填料、阳离子交换树脂均为Sigma公司产品；N糖苷酶F （PNGase F，美国BioRad公司）；牛胰核糖核酸酶B（Rib B，Worthington公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin，1∶250）、聚偏氟乙烯膜（PVDF， 0.45 μm）均购自西安舟鼎国有限公司；石墨碳柱、C18小柱（美国Waters公司）；其余试剂均为国产分析纯。健康人O型Rh（+）血清由西安交通大学附属医院提供；实验用水由Millipore Integral制备。 　　2.2质谱条件 　　质谱分析条件参考文献[9]。电喷雾离子源（ESI）；正负离子模式扫描，扫描范围为中分子量端m/z 150～2000及高分子量端m/z 2000～4000；电喷雾电压： 4.00 kV； 鞘气（N2）： 30.00 arb；