重组大鼠tgf-β1基因和igf-1基因转染兔膝关节治疗骨性关节炎的研究-recombinant rat tgf - β 1 gene and igf - 1 gene transfected into rabbit knee joint for the treatment of osteoarthritis.docx

华中科技大学问济医学院2001 华中科技大学问济医学院 2001 级博士学位论文 中文摘要 骨性关节炎 Costeoarthritis ，OA) 是一种老年人群多发的常见 的关节疾惫，在世界上其患病率仅次于心血管疾病居第二位，罹患该 病非常痛苦，严重影响生活质量。然而目前尚无有效的方法治疗队， 每年用于治疗队的费用相当惊人。病理研究发现，关节软骨的降解退 变是 OA 重要的病理改变。大量研究表明，某些生长因子如转化生长因 子。 C TGF- ? )、膜岛素祥生长因子 1 CIGF-l)、骨形态发生蛋白2、 7 (BMP-2 、7) 等均能不同程度地促进软骨细胞有丝分裂及增娼声提高 软骨细胞基质中蛋白多糖的含量，这对保护软骨细胞、防止软骨降解 具乎可积极的作用。然而，软骨细胞自身分泌的生长因子有限，而外源性 的生长因子出于药物半衰期以及血液循环和体内代谢的缘故，在软骨 损伤局部很难维持有效的治疗浓度，常需反复应用。近年来，随着分 子生物学和基因工程技术的发展 F 这一难题已经可利用转基因的方法 来解决。即将编码生长因子的基因片段整合到基因载体内，再将基因 载体转染入软骨细胞中，最后把成功转染了功能基因的软骨细胞注射 入关节腔内，通过转基因的软骨细胞持续大量分泌生长凶子来修复损 伤的关节软骨。也有报道将编码坐长因子的重组基因直接注射入关节 内修复软骨。在临床应用基因治疗队之前，有必要在细胞实验和动物 实验中确证明:些基因或基因的组合会对 OA 产位更好的治疗效果。在本 实验中，我们利用重组大鼠 TGF- ? 1 和 IGF-l 基因对此进行了初步的探 叶。 华中科技大学同济区学院2001 华中科技大学同济区学院 2001 级博士学位论文 第一部分 重组大鼠转化生长因子。 1 基因( pcDNA:J+ l、GF- ? 1) 和膜岛 素样生长因子 l 基因( pATl旷IGF-l) 的制备 目的 扩增、纯化重组大鼠基因 pcDNA川、GF- ? 1 和 pAT 1;):1+1GF- 1， 并进行酶切鉴定，为基因转染提供目的基因。方法 采用碱裂解法自 感受态菌株 HBI01 和 81..21 (DE3) 中大量摄取并纯化重组大鼠基因 pcDNA :，+TGF- ? 1 和 pAT 1ii:，I+GF寸，用 EcoRI 酶和 XbaI 酶对上述基因进 行酶切电泳鉴定。结果 重组大鼠基因 pcDNA 3 +TGF- ? 1和 pAT ，ii:J+ IGF-l 经酶切电泳后，其条带位置与相应的质粒图谱相附。结论 本实验所 提取并纯化的重组基因 pcDNA:I+TGF- ? 1 和 pAT ，:i汁IGF-l 是正确的。 第二部分 重组大鼠转化生长因子。 1 基因和膜岛素样生长因子 1 基因 体外转染兔软骨细胞后对其生物学性状的影响 目的 原讨重组大鼠 pc DNA:，+ TGF- ? 1 墓.四、 pAT 15:1+ 1GF-l 基因转 染兔软骨细胞后生物性状的变化，为骨性关节炎基因治疗中国的基因 的选择提供参考。方法 无菌条件下取新西兰白兔膝关节软骨，经消 化分离，软骨细胞以 L X 1Qii/ml 浓度培养于 6 孔培养板。传代扩增后， 软骨细胞分为 6 组，即空白对照组、报告基因 lac Z 转染组、质粒 pcD\J A :1 转染组、 pcDNA:，+TGF- ? 1 转染组、 pAT l53十 IGF-l 转染组、 pcDNA:，+TGP- ? 1 和 pAT !:i:1 + 1G F-1 共转染组。上述转染组均以脂质体为转染媒介 。筛选 2 华中科技大学同济医学院2001 华中科技大学同济医学院 2001 级博 1.学位论文 细胞阳性克降后，对软骨细胞所分泌的 TGF- ? 1 因子、 IGF-l 因子、 [ 1 型胶原进行原位杂交、免疫组化、免疫荧光检测，并用流式细胞仪 对软骨细胞生长周期进行分析， :H-TdR 的掺入实验检测软骨细胞的扩 增情况。结果 原位杂交、免疫组化和免疫荧光的结果灰度值分析显 示 F 单基因转染组和双基因共转染组的 TGF- ? 1、 [GF-l 以及[1 型股 !累的含量明显高子空白对照组和 pcDNA;，组CPO.05) 。双基因共转染 组的上述因子含量均高于 pcDNA;l+TGF- ? 1， pAT 1;;:1+ 1GF-l 单基因转染 组，且差异有显著性意义( PO. 05 ) 0 pcDNA 3+TGF- ? 1 单转染组与 pA T 15:1+ 1G F l 单转染组比较，前者的 TGF- ? 1、 11 型胶原的含量高于 后者忡忡.05) t 而 IGF一 l含量二二者差异无显著性意义作