离子色谱法测定大肠癌患者尿液中的甘露醇及乳果糖.doc

- PAGE 6 - PAGE PAGE 1 离子色谱法测定大肠癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖 付晓伶1， 周荣耀*1，潘广文2 (1.上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科，上海，201203 2. 戴安中国有限公司应用研究中心上海实验室，上海，201203） 摘要：建立了大肠癌患者尿液中甘露醇和乳果糖的高效阴离子交换分离—脉冲积分安培（HPAEC-PAD）检测方法。样品经稀释、净化、过滤后进行色谱分析，以氢氧化钠-乙酸钠梯度淋洗液为流动相，流速1.0 mL/min，采用Carbopac PA1（250 × 4 mm）阴离子交换柱分离，脉冲积分安培检测器（PAD）检测，外标法定量。结果表明，甘露醇和乳果糖的的线性范围为0.2-20 mg/L，相关系数分别为0.9995和0.9998，回收率为91.7% ~ 102.6%，相对标准偏差均小于2.09%，检出限为0.05和0.06 mg/L（以信噪比为3计）。该方法前处理简便，灵敏度高，重现性好。用于大肠癌患者尿液中的甘露醇和乳果糖测定 关键词：离子交换色谱；甘露醇；乳果糖；尿液 1引言： 乳果糖、甘露醇均为不被人体代谢的糖类，在正常情况下，不易被肠道吸收，在尿中含量很少。在病理情况下，肠粘膜受损，细胞间的紧密连接被破坏，细胞间隙扩大，通透性增加，通过细胞旁通道吸收的乳果糖(Latulose,L)量明显增加。而穿过小肠上皮细胞水溶性微孔吸收的甘露醇(Mannitol,M) ，其吸收量变化甚微，L与M的比值增大。L/M可排除胃排空时间，心输出量，肾排出量及尿液收集等误差对检测结果的影响，能真实地反映肠粘膜屏障通透性变化情况。大手术、创伤、烧伤、感染、脓毒症、肝硬化、放疗和化疗等应激可造成肠屏障结构和功能的损害，而肠通透性是评价肠屏障功能的一个重要指标。甘露醇和乳果糖被证明是能反映肠道屏障功能的有效方法。 高效阴离子交换——脉冲积分安培分离检测方法（HPAEC-IPAD）目前已经广泛应用于各种糖的分析测定。该方法主要依据糖类在碱性溶液中可呈现离子化状态，不同糖类的离子化程度不同，即pKa不同，根据糖类pKa的差异以及某些糖类与阴离子交换树脂之间的疏水性相互作用而实现在离子交换色谱柱上的分离。同时糖类的羟基在碱性溶液中具有电化学活性，在外加电压作用下，羟基易在金电极表面发生氧化还原反应，然后根据羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电量大小实现检测。该方法具有不用衍生、操作方便、灵敏度高、不使用有毒化学试剂和有机溶剂的优点，对糖类的检出限可以达到pmol数量级[1-4]。 尿液中甘露醇和乳果糖的测定方法有多种，目前以气相色谱法[5]及高压液相色谱仪[6,7]为主, 常用检测器是ELSD、MS和 RID，但它们都存在前处理繁琐、操作复杂或重复性不佳等缺点，特别是灵敏度低，达不到检测要求，且容易受到复杂基体的干扰。 离子色谱—安培检测分离度好、灵敏度高、比UV-ELSD和UV-RID法优势明显。于博昊等[8]人采用离子色谱的方法曾对幼兔尿样中的甘露醇和乳果糖进行定性定量检测，结果表明，离子色谱法能有效检测两种糖醇，且方便、快捷，具有良好的稳定性和重复性。冯蕾等[9]人曾建立了固相萃取-高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法测定癌症患者尿液中异黄蝶呤的分析方法，能去除大量干扰物质，该方法具有灵敏度高、选择性好、对环境造成的二次污染小等特点。 因此，本文尝试采用高效阴离子交换—脉冲积分安培法分离人体尿液中甘露醇和乳果糖，并应用于大肠癌患者尿液的实际样品测试。 2实验部分 2.1仪器、试剂与材料 Dionex ICS-3000离子色谱仪（美国戴安公司,包括四元梯度泵、金电极和安培检测器），Chromeleon 6.8色谱工作站，Barnstead-Nanopure纯水机，Anke TDL 80-2B离心机， CarboPac PA 1(250× 4 mm)分析柱，CarboPac PA 1(50 × 4 mm)保护柱，Onguard ⅡRP（2.5mL），0.22 ?m尼龙滤膜过滤头。 甘露醇（Augsburg Germany，批号：；乳果糖（中国药品生物制品检验所，批号：100057-200601）；50%氢氧化钠（Fluka 公司）、乙酸钠（生化级，Fluka）；实验用水均为大于18.2 MΩ?cm的二次去离子水。 2.2样品处理 2.2.1 大肠癌患者于治疗前1天早晨, 排晨尿后，口服测试液50ml，(乳果糖15ml，10g，甘露醇25ml，5g，纯净水10ml)，连续6 h 收集尿液, 并计总量, 混匀, 各时段取1 m l,置于-20℃的冰箱保存。 2.2.2 称取标样，用含20 mg/L NaN3超纯水配制1000 mg/L的甘露醇和乳果糖标准溶液，保存于冰箱冷藏室中。