重组人il-38的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用-preparation of recombinant human il - 38 and its effect on inhibiting pulmonary fibrosis in mice.docxVIP

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  • 2018-09-10 发布于上海
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重组人il-38的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用-preparation of recombinant human il - 38 and its effect on inhibiting pulmonary fibrosis in mice.docx

重组人il-38的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用-preparation of recombinant human il - 38 and its effect on inhibiting pulmonary fibrosis in mice

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方 外,论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果,也不包含为获得 宁波大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了 谢意。 若有不实之处,本人愿意承担相关法律责任。 签名: 日期: 关于论文使用授权的声明 本人完全了解宁波大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论 文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 (保密的论文在解密后应遵循此规定) 签名: 导师签名: 日期: 宁波大学硕士学位论文 重组人 IL-38 的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用 摘 要 目的:克隆人白细胞介素(interleukin,IL)-38 基因,构建其真核、原核表达载体,完 成 IL-38 重组蛋白的表达、纯化及活性分析;构建 IL-38 慢病毒表达载体,并进行其慢病 毒包装与鉴定,研究 IL-38 对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用及机制。方法:从人皮 肤组织中提取总 RNA,通过 RT-PCR 方法扩增 IL-38 基因的全长编码序列,将其克隆入真 核表达载体 pcDNA3.1/V5-His-TOPO,构建其 pcDNA-3.1-hIL-38-V5-His 重组质粒;以 pcDNA-3.1-hIL-38-V5-His 为模板扩增 IL-38 成熟蛋白编码区,构建 IL-38 pET-44-hIL-38 原 核表达载体,将测序正确的表达载体转化入 BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株中获得 IL-38 表 达工程菌株,用适当浓度的 IPTG 诱导工程菌株表达 IL-38 重组蛋白,并利用其 C 末端的 组氨酸标签(His-tag)进行镍离子亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的重组 IL-38 作用于脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)诱导的 THP-1 细胞,研究纯化 IL-38 蛋白的生物学活性;构建 IL- 38 慢病毒表达载体 pLVX-hIL-38-IRES-Green1,将该重组表达载体与其余三个包装载体共 转染 293T 细胞株,包装并收集慢病毒,建立博来霉素(bleomycin ,BLM)滴鼻给药 C57BL/6 雄性小鼠诱导的肺纤维化动物模型,将 IL-38 病毒上清滴鼻小鼠,研究 IL-38 对 小鼠肺纤维化发病的影响。结果:构建的 IL-38 真核、原核及慢病毒表达载体的测序结果 均与 GenBank 中的基因序列一致;IPTG 诱导产生的 IL-38 蛋白主要以可溶性形式存在, 纯化的目的蛋白经 SDS凝胶电泳分析和 Western blot 鉴定发现,蛋白纯度可达 98%,细胞实验证明纯化的目的蛋白具有较高的生物学活性;动物实验结果表明,IL-38 可 减少肺部炎症细胞的浸润、细胞外基质及胶原的沉积,可改善肺肺泡壁结构,可抑制肿瘤 坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-17、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)-1、巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)- 2、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等 前炎症因子和促纤维化因子的产生,也可促进抗纤维化因子干扰素(interferon,IFN)-γ 的产 生。结论:本文构建了 IL-38 的真核、原核表达载体和慢病毒载体,成功制备了具有生物 活性的 IL-38 重组蛋白并且成功包装了其慢病毒,利用慢病毒介导表达的 IL-38,对 IL-38 与博来霉素诱导小鼠肺纤维化的关系做了初步探讨,发现它具有减缓小鼠肺纤维化的作 用,为进一步进行 IL-38 的理论研究及临床应用研究奠定了基础。 关键词:IL-38,蛋白纯化,慢病毒,博来霉素,肺纤维化 I 重组人 IL-38 的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用 Preparation of recombinant human interleukin-38 and its inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice Abstract Objective: To clone the interleukin (IL)-38 gene, construct

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