重组人il-38的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用-preparation of recombinant human il - 38 and its effect on inhibiting pulmonary fibrosis in mice.docxVIP
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- 2018-09-10 发布于上海
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重组人il-38的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用-preparation of recombinant human il - 38 and its effect on inhibiting pulmonary fibrosis in mice
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若有不实之处,本人愿意承担相关法律责任。
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宁波大学硕士学位论文
重组人 IL-38 的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用
摘 要
目的:克隆人白细胞介素(interleukin,IL)-38 基因,构建其真核、原核表达载体,完 成 IL-38 重组蛋白的表达、纯化及活性分析;构建 IL-38 慢病毒表达载体,并进行其慢病 毒包装与鉴定,研究 IL-38 对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用及机制。方法:从人皮 肤组织中提取总 RNA,通过 RT-PCR 方法扩增 IL-38 基因的全长编码序列,将其克隆入真 核表达载体 pcDNA3.1/V5-His-TOPO,构建其 pcDNA-3.1-hIL-38-V5-His 重组质粒;以 pcDNA-3.1-hIL-38-V5-His 为模板扩增 IL-38 成熟蛋白编码区,构建 IL-38 pET-44-hIL-38 原 核表达载体,将测序正确的表达载体转化入 BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株中获得 IL-38 表 达工程菌株,用适当浓度的 IPTG 诱导工程菌株表达 IL-38 重组蛋白,并利用其 C 末端的 组氨酸标签(His-tag)进行镍离子亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的重组 IL-38 作用于脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)诱导的 THP-1 细胞,研究纯化 IL-38 蛋白的生物学活性;构建 IL- 38 慢病毒表达载体 pLVX-hIL-38-IRES-Green1,将该重组表达载体与其余三个包装载体共 转染 293T 细胞株,包装并收集慢病毒,建立博来霉素(bleomycin ,BLM)滴鼻给药 C57BL/6 雄性小鼠诱导的肺纤维化动物模型,将 IL-38 病毒上清滴鼻小鼠,研究 IL-38 对 小鼠肺纤维化发病的影响。结果:构建的 IL-38 真核、原核及慢病毒表达载体的测序结果 均与 GenBank 中的基因序列一致;IPTG 诱导产生的 IL-38 蛋白主要以可溶性形式存在, 纯化的目的蛋白经 SDS凝胶电泳分析和 Western blot 鉴定发现,蛋白纯度可达 98%,细胞实验证明纯化的目的蛋白具有较高的生物学活性;动物实验结果表明,IL-38 可 减少肺部炎症细胞的浸润、细胞外基质及胶原的沉积,可改善肺肺泡壁结构,可抑制肿瘤 坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-17、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)-1、巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)- 2、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等 前炎症因子和促纤维化因子的产生,也可促进抗纤维化因子干扰素(interferon,IFN)-γ 的产 生。结论:本文构建了 IL-38 的真核、原核表达载体和慢病毒载体,成功制备了具有生物 活性的 IL-38 重组蛋白并且成功包装了其慢病毒,利用慢病毒介导表达的 IL-38,对 IL-38 与博来霉素诱导小鼠肺纤维化的关系做了初步探讨,发现它具有减缓小鼠肺纤维化的作 用,为进一步进行 IL-38 的理论研究及临床应用研究奠定了基础。
关键词:IL-38,蛋白纯化,慢病毒,博来霉素,肺纤维化
I
重组人 IL-38 的制备及其抑制小鼠肺纤维化的作用
Preparation of recombinant human interleukin-38 and its inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice
Abstract
Objective: To clone the interleukin (IL)-38 gene, construct
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