舟山眼镜蛇细胞毒素ctx1优化分离及其活性分析-optimization of isolation and activity analysis of zhoushan cobra cytotoxin ctx 1.docxVIP

中文摘要 中文摘要 PAGE PAGE 2 舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1优化分离及其活性研究 硕士研究生：周升铭 导 师：孔天翰 教授 中文摘要 背景和目的： 细胞毒素(Cadiotoxins CTXs)是眼镜蛇毒中一类重要的活性蛋白，约占蛇毒总 蛋白含量 40%左右，它们的氨基酸序列和空间结构相当保守，但生物学活性却多种 多样，如引起可兴奋性组织去极化[1]、溶解肿瘤细胞[2]、心脏毒性[3]和抗菌活性[4] 等。不同地区、不同蛇种的蛇毒中含有不同的 CTXs，且即使是同种蛇毒中也含有 2～5 个 CTXs，它们的结构及生物学活性有一定差异[5] [6]，对它们的结构与功能的 研究是当今生物毒素研究的热点之一。本课题运用 CM-Sepharose FF 阳离子交换凝 胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒分离纯化，以提高分离效率和纯度；利用 RP-HPLC 内标法鉴定分离得到的单体；CTXs 具有广泛的生物活性，如镇痛、抑制 肿瘤增殖等，本研究利用热板法和醋酸扭体法初探 CTX1 的镇痛活性。利用 125I 同 位素标记法观察在生理条件下和吗啡成瘾条件下，研究 CTX1 在体内的分布情况， 对比两种情况下其脑组织内的分布情况，以考察在不同病理生理条件下，CTX1 在 血脑屏障的通透性。为进一步研究 CTX1 的药理作用打下基础。 方法： 一、舟山眼镜蛇毒CTX1层析分离的流速优化 1. 一步法对舟山眼镜蛇蛇毒进行纯化分离 收集舟山眼镜蛇原毒样本，经采 集处理后，运用CM-Sepharose FF阳离子交换凝胶柱层析，研究不同洗脱速度对蛇毒 蛋白分离纯化的影响。 2. Sephadex G-25层析洗脱脱盐 利用分子筛原理，将洗脱峰内含有的蛇毒蛋白 和盐溶液洗脱分离。研究不同洗脱速度对脱盐效率和结果的影响。 3. 舟山眼镜蛇毒单体成分的鉴定 采用 RP-HPLC，内标法鉴定分离纯化的舟 山眼镜蛇蛇毒单体，与标准品比较保留时间，确定分离单体的成分。 二．CTX1的毒性及镇痛活性测定 1. 急性毒性实验 Bliss 法检测 CTX1 的 LD50。通过预实验确定 100%致死量 和 0%致死量。由高浓度开始，药物浓度依次稀释 0.8 倍，共设 5 个浓度梯度。给药 后观察 48h，记录死亡时间和中毒症状。 2. 急性疼痛实验 运用热板实验和醋酸扭体实验测定CTX1对生理性疼痛的 镇痛作用。 三．CTX1的体内分布及对不同模型小鼠血脑屏障的通透性 1. 小鼠吗啡成瘾模型的建立 采用吗啡剂量递增法建立小鼠吗啡成瘾模型，腹 腔注射纳洛酮，观察小鼠的戒断症状以及体重变化，评价成瘾模型的是否成功。 2. 125I同位素标记CTX1 采用氯胺酮氧化法，将CTX1标记125I，利用Sephadex G-50分子筛将标记与未标记的125I分离；纸层析法检验125I的标记率。 3. 小鼠尾静脉注射125I- CTX1，不同的时间点取各脏器，检测cpm值，以比较 CTX1在体内的分布情况；通过两种模型的对比，研究CTX1在不同病理生理条件下， 通过血脑屏障的能力。 四．统计分析 采用 t 检验、χ2 检验，SPSS软件等统计分析实验数据。 结果： 1. 运用 CM-Sepharose FF 阳离子交换凝胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒分离 纯化，流速 V=1.6ml/min 时，分离结果理想，得到高纯度的蛇毒单体。 2. 运用 RP-HPLC 法，将分离的组分 SV6 与 CTX1 内标法对比，结果保留时间 一致，判断组分 SV6 与 CTX1 为同一成分（注：文中用 CTX1 表示组分 SV6）。 3. CTX1 急性毒性和镇痛活性的测定 结果显示 CTX1 的 LD50 为 4.33±0.56 mg/kg。CTX1具有良好的镇痛活性，具有剂量依赖性，治疗指数高。 4. 在生理条件下，CTX1在肾脏的分布最高，脑部的分布量很少；在吗啡成瘾 模型条件下，CTX1在脑内的分布量明显增加。 结论： 1. 舟山眼镜蛇原毒经 CM-Sepharose FF 阳离子交换凝胶柱层析分离得到高纯度 单体，洗脱流速为 1.6ml/min 时分离效果最佳。 2. CTX1 具有镇痛作用，且呈剂量依赖性。 3. CTX1 在生理条件下，较少通过血脑屏障；在吗啡成瘾模型小鼠，能明显通 过血脑屏障。 关键词：眼镜蛇；CTX1；镇痛；同位素示踪；RP-HPLC。 英文摘要 英文摘要 Purification and Pharmacological activity of cytotoxin 1 from Naja atra Cantor venom Background: Graduate：Zhou Shengming Tutor：Prof. Kong